分子生物學(xué)試驗(yàn)方法探討二－瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)

分子生物學(xué)試驗(yàn)方法探討二－瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)
    天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下。
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。
（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。
    目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。
    瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。

二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
    瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時(shí)行比較，便可測出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

        表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
瓊脂糖濃度 /%    0.3    0.6    0.7    0.9    1.2    1.5    2.0
線狀DNA大小/kb  60-5  20-1  10-0.8  7-0.5  6-0.4  4-0.2  3-0.1

2、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
    不同構(gòu)型DNA的移動速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進(jìn)（Rm>0），由此可見，這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。
3、電泳方法
（1）凝膠類型 
    用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時(shí)，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因?yàn)樗颇z和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統(tǒng) 
    缺少離子時(shí)，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5×溶液，用時(shí)稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備 
    以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。
（4）樣品配制與加樣 
    DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳 
    瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強(qiáng)度增加時(shí)，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的**大分辨率，電場強(qiáng)度不宜高于5V/cm。
    電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳，只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時(shí)，為增加凝膠硬度，可在4℃進(jìn)行電泳。
（6）染色和拍照 
    常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

三、印跡轉(zhuǎn)移電泳
    生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對電泳分離后的DNA進(jìn)行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進(jìn)行雜交操作，1975年，Southren創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜（NC膜）上，再進(jìn)行雜交的方法，被稱為Southren印跡法。隨后，Alwine等將類似方法用于RNA印跡，被戲稱為Northern印跡，1979年Towbin等設(shè)計(jì)了將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的裝置，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再與相應(yīng)的抗體等配體反應(yīng)，被戲稱為Western印跡，這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀，用低電壓高電流電泳完成轉(zhuǎn)移。1982年Reinhart等用電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶從凝膠轉(zhuǎn)移到特定膜上，稱Eastern印跡。
目前國內(nèi)外有多種核酸、蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移的電泳裝置出售，使印跡轉(zhuǎn)移速度快效率高、重復(fù)性好，應(yīng)用更加廣泛。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳，但轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)時(shí)，凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉(zhuǎn)移電泳的支持膜亦有多種選擇，近些年用尼龍膜較多，因?yàn)槟猃埬C(jī)械性能好，烘烤不變脆，使用時(shí)比硝酸纖維素膜更方便。
    進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移電泳時(shí)，要注意緩沖液的離子強(qiáng)度要低，pH要遠(yuǎn)離pI，使蛋白質(zhì)帶有較多電荷，一般用穩(wěn)定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當(dāng)提高電壓或電流可以提高轉(zhuǎn)移速度，但亦會增加熱效應(yīng)，故電壓或電流不可過高。

四、交變脈沖電場凝膠電泳
    一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因?yàn)樵诃傊悄z中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時(shí)，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時(shí)改變電場方向，則DNA分子必須改變其構(gòu)象，沿新的泳動方面伸直，而轉(zhuǎn)向時(shí)間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。1983年Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時(shí)間（外推為0的滯留時(shí)間）與DNA分子大小有關(guān)的特性，設(shè)計(jì)了脈沖電場梯度凝膠，交替采用兩個(gè)垂直方向的不均勻電場，使DNA分子在凝膠中不斷改變方向，從而使DNA按分子大小分開。后來Carle等改進(jìn)了電泳技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉(zhuǎn)換電場(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一水平式電泳槽和兩組獨(dú)立、彼此垂直的電極組成，一組電極負(fù)極為N，正極為S；另一組負(fù)極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板（10cm*10cm或20cm*20cm）呈45度放中央。電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時(shí)間長短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。電泳時(shí)，DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時(shí)，DNA分子就要有一定的時(shí)間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當(dāng)DNA分子達(dá)到一定構(gòu)型后，才能繼續(xù)前時(shí)。DNA分子凈移動方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬堿基對的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時(shí)間均可調(diào)，使用更加方便。
    此外，瓊脂糖平板常用于免疫擴(kuò)散技術(shù)的電泳技術(shù)相結(jié)合的多種免疫電泳。