SDS - PAGE及染色技術(shù)在蛋白質(zhì)的分析中, 具有設(shè)備簡單, 操作方便, 所需樣品量少( 1 ～100μg) , 分辨率較高等優(yōu)點(diǎn), 在分析或研究中應(yīng)用范圍廣泛1可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備, 還可用于測定分子量、等電點(diǎn)等〔1 - 2〕1該方法主要依據(jù)SDS - 聚丙烯酰胺凝膠體系中, 使蛋白質(zhì)樣品與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物, 由于復(fù)合物的分子量不同,在電泳中反映出不同的遷移率, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品在該系統(tǒng)電泳中所作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 就可以推算出被測蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)分子量1在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中, 蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小, 而其他因素對(duì)電泳遷移率的影響可以忽略不計(jì)〔3 - 5〕1因此, 快速有效地利用SDS -PAGE及染色技術(shù)進(jìn)行相關(guān)領(lǐng)域研究是十分有必要的
1 材料與方法
111 試劑和主要儀器
SDS、Tris - base、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)均購自北京鼎國生物有限公司, 丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺購自華美生物工程公司, 5804R高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf公司產(chǎn)品, 紫外分光光度計(jì)購自日本島津, 24D垂直
電泳槽為
北京六一公司產(chǎn)品
112方法
11211凝膠電泳溶液的配制
凝膠溶液、樣品處理液、電泳緩沖液及考馬斯亮藍(lán)染色液均按文獻(xiàn)〔6〕方法配制及存儲(chǔ); 銀染液的配制、保存均按文獻(xiàn)〔7〕方法1
11212 不同濃度凝膠分離標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)
采用垂直、不連續(xù)SDS - PAGE對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品和牛血清白蛋白組分五進(jìn)行分析1凝膠濃度分別為: 濃縮膠濃度為315% , 分離膠濃度分別為8%、10%、12%和15%1將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品、牛血清白蛋白組分五分別與樣品緩沖液等體積混合后沸水浴3 - 5min, 上樣1置于
電泳儀, 恒流40mA電泳分離各種蛋白質(zhì)樣品1電泳完畢后固定凝膠, 并用銀染或考馬斯亮蘭染色和顯色1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品含有分子量分別為615、1615、2510、3215、4715、6210、8310、17510kD的成分, 作為小、中、大分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì), 用牛血清白蛋白組分五(BSA分子量: 6612kD) 與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分別在8%、10%、12%和15%的凝膠中進(jìn)行電泳, 以進(jìn)行凝膠濃度選擇實(shí)驗(yàn)1\
11213 蛋白質(zhì)凝膠電泳的染色
分離膠用去離子水沖洗干凈, 置于含有凝膠體積10倍左右固定液的培養(yǎng)皿中, 室溫放置于
脫色搖床, 固定4 - 12h1分別采用考馬斯亮藍(lán)染和銀染, 進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果分析
