1.掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理。

2. 掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國(guó)PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析**常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)較簡(jiǎn)單。

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱**94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降**55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

三、實(shí)驗(yàn)試劑與器材

模板DNA、2.5mmol/L dNTP

Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR儀、移液槍、PCR板

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、配制20μL反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：

模板DNA    2μL

引物1      1μL

引物2      1μL

dNTP      1.5μL

MgCl2        2μL

10×buffer    2μL

ddH2O      10μL

Taq酶      0.5μL

2、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。

3、上樣，啟動(dòng)反應(yīng)程序。

4、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。

附PCR技術(shù)應(yīng)用

1、生命科學(xué) a、人類基因組計(jì)劃 隨著的PCR日臻完善，科學(xué)家于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎(chǔ)上，經(jīng)過整理、分類和排列后得到的更加準(zhǔn)確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對(duì)人類基因組基本面貌的**揭示，表明科學(xué)家們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊(yùn)涵的內(nèi)容。 b、后基因組計(jì)劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態(tài)性及其單倍型以及尋找其在生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中重要成為人們關(guān)心的熱點(diǎn)。以研究基因功能為核心的“后基因組時(shí)代”已經(jīng)來臨，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組、蛋白質(zhì)組以及藥物基因組的研究計(jì)劃已經(jīng)成為新的熱點(diǎn)。 c、物種的分類、進(jìn)化及親緣關(guān)系 可以進(jìn)行物種進(jìn)化的保守性分析及物種多態(tài)性分析、物種鑒定。

2、醫(yī)藥 a、疾病的診斷和治療 遺傳性疾病：如地中海貧血、鐮刀狀細(xì)胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚**腫瘤中的一部分，均可預(yù)測(cè)；癌基因的檢測(cè)和診斷：檢測(cè)惡性腫瘤的標(biāo)記物來診斷癌癥等疾?。焕没蛑委煼椒ㄖ委熌[瘤性疾病。 b、致病病原體的檢測(cè) 檢測(cè)范圍包括細(xì)菌、病毒（SARS及禽流感病毒H5N1等）、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物。檢測(cè)的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)高于當(dāng)前的免疫學(xué)方法，所需時(shí)間也已達(dá)到臨床要求，這對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒（乙肝），細(xì)菌（如結(jié)核、厭氧菌）和原蟲（如梅毒螺旋體）等來說尤為適用。 c、DNA指紋、個(gè)體識(shí)別（DNA身份證）、親子關(guān)系鑒別和法醫(yī)物證 可以用一根頭發(fā)、一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)精子來完成上述工作，這一領(lǐng)域也已發(fā)展到骨髓或臟器移植配型。 d、生物工程制藥 許多藥物可通過工程菌和細(xì)胞來大量生產(chǎn)，如干擾素、白介素、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素等藥物。 e、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥及疾病模型 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與醫(yī)學(xué)及生物醫(yī)藥研究的關(guān)系越來越密切。近年來,各種人類疾病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型不斷建立。如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在遺傳病、心血管疾病、腫瘤、高血壓病、病毒性疾病、異種移植、輸血醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)研究中的應(yīng)用；利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物-乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白,好比在動(dòng)物身上建“藥廠”,可以從動(dòng)物乳汁中源源不斷地獲得具有穩(wěn)定生物活性的基因產(chǎn)品。這是一種全新的藥物生產(chǎn)模式,具有投資成本低,藥物研制周期短和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)。

3、農(nóng)業(yè)科學(xué) a、轉(zhuǎn)基因植物 按其功能主要分提高產(chǎn)量、抗病力、抗除草劑、改良品質(zhì)和發(fā)育調(diào)節(jié)。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。 b、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 在農(nóng)業(yè)方面，主要在改良畜禽生產(chǎn)性狀,提高畜禽抗病力及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜產(chǎn)品。

4、考古學(xué)及歷史事件解讀利用人類短串聯(lián)重復(fù)STR-PCR技術(shù)，研究人類種族的遺傳多態(tài)性，效果非常穩(wěn)定。目前此技術(shù)已廣泛用于生物考古、種系發(fā)育、民族學(xué)、人類學(xué)和考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域中。

5、衛(wèi)生安全 a、食品微生物的檢測(cè) 傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)首先經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)用PCR技術(shù)則非常迅速、準(zhǔn)確。主要用于：食品致病菌的檢測(cè)，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測(cè)；水中細(xì)菌指標(biāo)測(cè)定。 b、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè) 目前世界轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)有100多物種，大多數(shù)已經(jīng)用于食品。轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人體健康的危害及對(duì)生態(tài)的影響也日受世界廣泛的重視，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)成為控制其泛濫的一種手段。 c、動(dòng)、植物檢疫　靈敏、特異、快速診斷檢測(cè)方法是我國(guó)進(jìn)出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入**的人員、動(dòng)、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動(dòng)物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于**之外，是提高我國(guó)綜合國(guó)力的必要保證。