SDS 平板膠片鑄造︰

1） 整理出兩組玻璃片及白板鑄膠組合，先用酒精拭凈，并選擇合適的間隔條（0.75 mm） 組合起來。請(qǐng)熟悉鑄膠三明治組合的正確組裝方式，以免灌入的膠液漏出來。

2） 三明治組合后直立站好，準(zhǔn)備所要濃度的SDS 膠體溶液如表4.2. 兩片0.75mm 厚的平板膠片約需10 mL 分離膠體溶液，以及5 mL 焦集膠體溶液。APS液到**后才加入，未加APS 以前可在真空中抽去溶液中的氣體。

配制兩片0.75 mm 膠片所需膠體 （mL）

3） 以上分離膠體各成份在小燒杯中混合均勻后，可直接沿著玻璃一側(cè)倒入鑄膠組合到預(yù)定高度 （約八成高），勿陷住氣泡；再輕輕加上一層isopropanol. 也可使用滴管慢慢加入膠體，同樣勿注入氣泡。

4） 約30 min 可凝結(jié)，以濾紙吸去isopropanol,同法倒入焦集膠體溶液，要加到滿；盡快插入樣品槽齒模，注意不可有氣泡陷在膠體中。一般在凝膠完成后，膠體與所加的水層的間，會(huì)出現(xiàn)清楚的直線界面，但因?yàn)楸尘盀榘咨?，較不易觀察的。

5） 再度凝結(jié)后取下齒模即可使用。若不立刻使用，則把整個(gè)膠片組合用保鮮膜包好，膠面上方加一水層，勿使干掉，在4℃約可放1~2 周。

電泳方法︰

6） 若膠片組合保存于4℃，則要等待膠片完全回復(fù)室溫，才架到電泳槽。膠片一定要完全回溫，否則在進(jìn)行電泳時(shí)，玻璃會(huì)因熱脹而破裂。

7） 取F液稀釋成一倍溶液，并加SDS成為0.1%;先倒入下方的正極槽，注意不可有氣泡黏在膠體，然后倒入上方的負(fù)極槽。用微量針筒或微量移液器一個(gè)一個(gè)清洗樣本槽，除去殘留在槽內(nèi)的膠體 （刷牙）。刷牙的動(dòng)作很重要，而且要徹底，否則注入樣本時(shí)，會(huì)有大麻煩。又因?yàn)榘咨趸X板乃白色背景，不容易看出樣本槽的位置，可用Hoefer 所附的透明樣本槽位置模板，作為指引，順便可練習(xí)樣本添加的動(dòng)作。

8） 取蛋白質(zhì)樣本溶液，加入同體積E 液，以及適量追蹤染料bromophenol blue,混勻后在100℃加熱10 min.放冷短暫離心后即可依次以微量移液器注入樣本槽，樣本體積可自斟酌，但要記好位置及體積；通常都使用5~15uL.注入樣本時(shí)，盡量把針頭或吸管伸到樣本槽底部，但不要觸到樣本槽底的膠面，則可以使得樣本所占的體積**小，分離效果較好。

9） 裝上電源蓋，以100~150 V進(jìn)行電泳，**高可加**200 V,視實(shí)驗(yàn)的緊急程度，以及膠片發(fā)熱的情形而定。通電后兩極附近會(huì)立刻產(chǎn)生無數(shù)細(xì)微氣泡，是通電的特征。

10） 追蹤染料很快進(jìn)入膠體，開始焦集成藍(lán)色細(xì)線，并向下泳動(dòng)，大約1 h 可泳動(dòng)到底邊，中止電泳，除去電源蓋。有些分子量較大的樣本，或使用濃度較高的膠片，可以等到藍(lán)色細(xì)線泳出膠體才停止。

膠片染色法：

11） 取出膠片組合，使玻璃板向上，先除去兩側(cè)間隔條，再以扁形藥匙輕輕撬起玻璃，膠片則留在白板上。切除焦集膠體，并在分離膠片的右上方截角做記號(hào) （區(qū)別膠片的左右）。
12） 取染色盤 （大約比膠片稍大），倒入CBR染色液，在染色盤上方把上述白板倒翻過來，挑起膠片一角，利用重力使膠片掉落到染色缸中。若要進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印，則膠片不能染色，要浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中。13） 在CBR 中染色約30 min,染色盤要加密蓋，置于旋轉(zhuǎn)平臺(tái)慢速50 rpm 搖蕩的；要注意膠片是否完全沒入染色液中，否則會(huì)造成染色不均勻。14） 染色后小心把CBR 染劑倒回原來瓶中，整塊膠片變成藍(lán)色，先用自來水洗掉殘余的染色液，再倒入約20 mL 脫色液，加密蓋后再放回旋轉(zhuǎn)平臺(tái)搖蕩。染色脫色過程請(qǐng)戴手套，否則會(huì)在膠片上留下指紋。15） 膠片的藍(lán)色背景漸漸脫掉，待脫色液轉(zhuǎn)成藍(lán)色后，可以換新脫色液；如此脫色數(shù)次，在一小時(shí)內(nèi)應(yīng)可看到蛋白質(zhì)的藍(lán)色色帶出現(xiàn)。用過的脫色液，請(qǐng)回收倒在有機(jī)溶液的廢液桶中。16） 待膠片背景完全透明后，染色脫色完成。倒去脫色液，改用50%甲醇液洗一兩次，待膠片縮**大約原來的尺寸，則可準(zhǔn)備干燥的。膠片干燥法：17） 把玻璃紙cellophane 先用水浸濕，平鋪在干燥用的玻璃片上，玻璃紙會(huì)比玻璃片大，因此四周有多出來的部份。18） 把膠片平鋪在玻璃紙中央，膠片與玻璃紙間不要有任何氣泡。 除了氣泡的外，若膠片沒有回復(fù)原來的大小，或者膠片的四邊有傷痕，都很容易造成膠片干燥后的龜裂現(xiàn)象。19） 在膠片上再加一層浸濕的玻璃紙，也不要陷有氣泡在內(nèi)；把玻璃紙多出來的部份反折到玻璃背面，用手抹平表面水份，并用紙巾吸干。20） 把此干片三明治組合放在桌上，次日即可得到已經(jīng)干燥好的膠片，用電風(fēng)扇或冷氣機(jī)吹的，可以加快干片速度。 干片后用指甲尖輕敲膠片，若還可以看到指甲所留下的痕跡，表示膠片并未完全干燥，要再等候。21） 待膠片完全干燥后，以美工刀或剪刀去除多余的玻璃紙，再加以護(hù)貝，則可**保存的。免疫染色的轉(zhuǎn)印紙，也可以護(hù)貝保存。