實(shí)驗(yàn)步驟：
1.分別配制 5%濃縮膠和12%分離膠
      12%分離膠10mL     5%積層膠6mL
H2O   3.3mL   H2O   4.20mL
30% Acrylamide   4mL   30% Acrylamide   1mL
pH8.8 Tris HCl（1.5M）  2.5mL   PH6.8Tris HCl（1M） 0.76mL
10%APS   100uL   10%APS   60uL
10%SDS   100uL   10%SDS   60uL
TEMED   7.6uL   TEMED   6uL

分離膠：分離膠配制完畢即可進(jìn)行灌膠，灌膠結(jié)束后使用ddH2O進(jìn)行液封。當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已經(jīng)凝好。（一般要等1.5h）
積層膠：倒掉分離膠上層的水并用吸水紙吸干，配制積層膠并進(jìn)行灌膠，插入梳子。積層膠凝固完全后拔掉梳子，準(zhǔn)備上樣電泳。（一般凝固0.5h以上）

2.電泳：
上樣順序如下：
細(xì)胞裂解液15ul  細(xì)胞裂解液15ul  預(yù)染蛋白Marker 10uL 細(xì)胞裂解液15ul 細(xì)胞裂解液15ul
  
電泳條件：90V 1.5h 。

3.轉(zhuǎn)印：
電泳結(jié)束后，取出膠，剪相應(yīng)大小的一張硝酸纖維素膜和六張濾紙，將膠、膜、濾紙和海綿放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸透，取夾子，按照“海綿—三層濾紙—膠—硝酸纖維素膜—三層濾紙—海綿”的順序安裝好，每一步都要避免產(chǎn)生氣泡，放入轉(zhuǎn)印裝置中，使膠靠近負(fù)極，膜靠近正極。
轉(zhuǎn)印條件：90mA， 90min。

4.封閉：
膜片置于封閉液（PBS / 5%脫脂奶粉）中，4℃過(guò)夜封閉。
取出膜PBST洗三次，每次洗 5 min。

5.一抗孵育：
稀釋液為1%的PBS脫脂奶粉
一抗（鼠抗）稀釋500倍（說(shuō)明書(shū)上為500-1000倍）。70r/min，室溫孵育3h。
PBST洗3次，每次8 min。

6.二抗孵育：
稀釋液為1%的PBS脫脂奶粉
使用AP標(biāo)記的羊抗小鼠的二抗，稀釋約30000倍。70r/min，室溫孵育2h。
PBST洗3次，每次8 min。

7.顯色
按照以下配方配制NBT/BCIP顯色液：
NBT原液：NBT 40mg 加0.7％的DMF 1.2mL混勻，4℃避光保存(用鋁箔包裹)；
對(duì)照、待測(cè)NBT，各配一組。
BCIP原液：BCIP 20mg加100％的DMF 1.2mL混勻，4℃避光保存(用鋁箔包裹)。
顯色緩沖液：0.1M Tris HCl ，0.1M NaCl ，50mM MgCl2，pH 9. 5。

使用時(shí)BCIP和NBT各10uL加在1mL緩沖液中，EP管中混勻，滴到膜上，避光處顯色，5~10分鐘。見(jiàn)條帶后，水洗，中止顯色。

如果是DAB顯示的話，其他步驟一樣，就是**后一步顯示，按照DAB顯示試劑盒要求操作就可以了。