Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印跡
一：蛋白質(zhì)的提取
1、取出細胞，倒去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一次，充分除去PBS液體，把細胞置于冰上。配置細胞裂解液，細胞裂解液用滅菌水配置，然后按照1：100比例加入PMSF混勻，然后按照細胞的多少加入裂解液于培養(yǎng)瓶中，在冰上放置20min。在此期間每隔3-5min搖晃培養(yǎng)瓶，讓其充分裂解細胞。
2、裂解結(jié)束后，吸取裂解液于另一只1.5ml離心管中，于4℃13000r/min 離心15min。
3、離心結(jié)束后，吸取離心管內(nèi)上清于另一只干凈離心管中。于-20℃保存。
4、根據(jù)上樣量的多少，計算需要處理的樣品，在處理樣品時按照1：1比例加入2×buffer。于100℃煮5-10min。結(jié)束后短暫離心，于4℃?zhèn)溆谩?br />
二、主要試劑的配制：
1、30%丙烯酰胺溶液：取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加水**100ml，過濾，棕色瓶內(nèi)避光4℃保存；
2、1.5M Tris-HCl分離膠緩沖液，pH8.8 (4x)：取18.15g Tris，用1M HCl調(diào)pH**8.8，加水**100ml，4℃保存；
3、1.0M Tris-HCl在濃縮膠緩沖液，pH 6.8(8x)：取12g Tris，用1M HCl調(diào)pH**6.8，加水**100ml，4℃保存；
4、電極緩沖液：pH8.3( 1x)：取28.8g甘氨酸，6.04g Tris堿，加10ml 10% SDS，加水**1L，室溫保存；
5、10% SDS溶液：取10g SDS，加水**100ml，完全溶解后室溫保存。
6、10%過硫酸銨溶液(APS):取0.1g過硫酸銨,加水**1ml,每次用前新鮮配制
7、2X樣品緩沖液 0.1M TrisCL，PH6.8；0.2M DTT；4%SDS；2%溴酚蘭 ；20%甘油
8、電轉(zhuǎn)印液 pH 8.2-8.3： 甘氨酸 14.42g，Tris base 3.02g，dH2O 800ml，甲醇 200ml， 1N HCL調(diào)定pH值**8.2-8.3，室溫放置 。
9、考馬斯亮藍染色液：考馬斯亮藍R-250 0.25g，甲醇 45ml ，dH2O 45ml，加入冰乙酸10ml, 過濾后使用。
10、脫色液：1號脫色液：甲醇250ml冰乙酸 50ml 加dH2O定溶**500ml； 2號脫色液：甲醇 100ml，冰乙酸 75ml，加dH2O定容**1000ml
11、抗體稀釋液：1%BSA/PBS。
12、封閉液：2.5-5%脫脂奶粉
三、電泳
1、配置12% SDS-PAGE凝膠電泳
2、配
電泳槽，配5%濃縮膠：水 5.5ml，30%丙烯酰胺 1.3ml，1M Tris（PH6.8）1.0ml，10%SDS 0.08ml，取其中1ml與10%APS0.1ml及TEMED4ul混合，封
電泳槽，其余備用。
3、配12%分離膠：水 6.6ml，30%丙烯酰胺 8.0ml，1.5M Tris（PH8.8）5.0ml，10%SDS 0.2ml，10%APS 0.2ml，TEMED0.008ml混合，灌膠。小心覆蓋一層液體(75%乙醇)。
4、膠凝后，棄掉覆蓋層液體，在濃縮膠中加 10%APS0.08ml，TEMED4ul混合灌膠，在插梳子時小心避免氣泡。
5、開始所加電壓為80V，**溴酚藍進入分離膠，將電壓升**120V，溴酚藍到達分離膠底部約0.5cm ( 4—5h左右)，電泳完畢，關(guān)閉電源。取下凝膠，一塊用于考馬斯亮藍染色，另一塊用于轉(zhuǎn)印。
6、凝膠考馬斯亮蘭染色
a. 待溴酚蘭指示劑到達分離膠下沿約0.5cm時，關(guān)掉電源，傾去緩沖液，取下膠塊置于染色盒染色。
b. 染色：在染色盒內(nèi)倒入染色液，37℃染色3─5h(或室溫過夜)。
c. 脫色：用脫色液浸泡，**好能夠振搖，換2-3次脫色**背景無色。
d. 凝膠成像保存：用
凝膠成像系統(tǒng)將脫色后的凝膠掃描成像保存。
3. 免疫轉(zhuǎn)印：
3.1 小心拆開電泳裝置，將膠切角以空位，并將之浸入100ml轉(zhuǎn)移buffer平衡15min。
3.2 推薦預(yù)先配好電泳buffer并置于4℃以使之充分去除氣體。
3.3 切出比膠稍大的PVDF，在與膠對應(yīng)處切角作記號。
3.4 以100%甲醇濕潤膜15sec，然后轉(zhuǎn)入dH2O中浸潤2min。
3.5 轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)印buffer中平衡5min以上。
3.6 組裝轉(zhuǎn)印三明治，它由多孔墊片、濾紙（一層）、PVDF、膠、濾紙、多孔墊片組成。
3.7 合上轉(zhuǎn)印盒子，插入轉(zhuǎn)印
電泳槽，凝膠面對向負極。
3.8加入足量buffer以45V電壓4℃轉(zhuǎn)印18-20hr。
3.9 轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取出膜并使之干燥，以增強蛋白質(zhì)結(jié)合，室溫晾干30min。
4.免疫雜交：（均在室溫、振搖條件下進行）
4.1晾干后的膜在2.5%脫脂奶粉-PBS(或者用封閉液)中封閉2 hr。
4.2以PBS洗膜2次×5分鐘。
4.3稀釋一抗于1％BSA／PBS中與膜孵育1小時。
4.4PBS洗膜15分鐘一次，以后再洗4次×5分鐘。
4.51％BSA／PBS稀釋HRF－標(biāo)記的二抗并與膜孵育1小時。（其他顯色方法）
4.6洗膜：同步驟4。
4.7溶液A與B各0.5毫升等體積混合后，振搖條件下與膜共育1分鐘。注意：避光條件下操作。
4.8吸除過量的化學(xué)發(fā)光試劑，將膜包裹于保鮮膜中。
4.9在暗盒中曝光X片30秒，沖洗膠片，根據(jù)結(jié)果調(diào)整**適曝光時間。
