一、試驗(yàn)意圖
瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢查核酸的辦法，學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的運(yùn)用技能，掌握有關(guān)的技能和識(shí)讀電泳圖譜的辦法。 二、試驗(yàn)原理
瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于別離、鑒定DNA、RNA分子混合物的辦法，這種電泳辦法以瓊脂凝膠作為支持物，運(yùn)用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，到達(dá)別離混合物的意圖。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的搬遷速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子自身的巨細(xì)和構(gòu)型是首要的影響要素。DNA分子的搬遷速度與其相對(duì)分子量成反比。不一樣構(gòu)型的DNA分子的搬遷速度不一樣。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不一樣構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的搬遷速度巨細(xì)次序?yàn)?cccDNA＞IDNA＞ocDNA
核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個(gè)磷酸基團(tuán)中只要一個(gè)磷酸解離，所以分子帶正電，在電場(chǎng)中向負(fù)極泳動(dòng)；而 pH8.0-8.3時(shí)，堿基幾乎不解離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。不一樣的核酸分子的電荷密度大致一樣，因而對(duì)泳動(dòng)速度影響不大。在中性或堿性時(shí)，單鏈DNA與等長(zhǎng)的雙鏈DNA的泳動(dòng)率大致一樣。
影響核酸分子泳動(dòng)率的要素首要是： 1、樣品的物理性狀
即分子的巨細(xì)、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。通常而言，電荷密度愈大，泳動(dòng)率越大?？墒遣灰粯雍怂岱肿拥碾姾擅芏却笾乱粯?，所以對(duì)泳動(dòng)率的影響不明顯。
對(duì)線形分子來說，分子量的常用對(duì)數(shù)與泳動(dòng)率成反比，用此規(guī)范樣品電泳并測(cè)定其泳動(dòng)率，然后進(jìn)行DNA分子長(zhǎng)度（bp）的負(fù)對(duì)數(shù)——泳動(dòng)間隔作規(guī)范曲線圖，能夠用于測(cè)定不知道分子的長(zhǎng)度巨細(xì)。
DNA分子的空間構(gòu)型對(duì)泳動(dòng)率的影響很大，比方質(zhì)粒分子，泳動(dòng)率的巨細(xì)次序?yàn)椋篶DNA＞IDNA＞ocDNA可是因?yàn)榄傊菨舛?、電?chǎng)強(qiáng)度、離子強(qiáng)度和溴化乙錠等的影響，會(huì)呈現(xiàn)相反的狀況。 2、支持物介質(zhì)
核酸電泳通常運(yùn)用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)，瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不一樣濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔巨細(xì)不一樣，是于別離不一樣濃度規(guī)模的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和過硫酸銨（AP）的催化下聚合形生長(zhǎng)鏈，并經(jīng)過交聯(lián)劑N,N′-亞甲雙丙烯酰胺（Bis）穿插銜接而成，其網(wǎng)孔的巨細(xì)由Acr與Bis的相對(duì)份額決議。
瓊脂糖凝膠合適別離長(zhǎng)度100**60的分子，而聚丙烯酰胺凝膠關(guān)于小片段（5bp-500bp）的別離作用**佳。挑選不一樣濃度的凝膠，能夠別離不一樣巨細(xì)規(guī)模的DNA分子。 3、電場(chǎng)強(qiáng)度
電場(chǎng)強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有用別離規(guī)模跟著電壓增大而減小，所以電泳時(shí)通常選用低電壓，不超越4V/cm。而關(guān)于大片段電泳，乃**用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進(jìn)行高壓電泳時(shí)，只能運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠。 4、緩沖液離子強(qiáng)度
核酸電泳常選用TAE、 TBE、TPE三種緩沖體系，但它們各有利弊。TAE價(jià)格低廉，但緩沖才能低，必須進(jìn)行南北極緩沖液的循環(huán)。TPE在進(jìn)行DNA收回時(shí)，會(huì)使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反響。所以多選用TBE緩沖液。
在緩沖液中參加EDTA，能夠鰲合二價(jià)離子，按捺DNase，維護(hù)DNA。 緩沖液pH常偏堿性或中性，此刻核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。
核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠是一種扁平分子，能夠嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間。在紫外線照耀BE-DNA復(fù)合物時(shí)，呈現(xiàn)不一樣的效應(yīng)。254nm的紫外線照耀時(shí)，靈敏度**高，但對(duì)DNA損害嚴(yán)峻；360nm紫外線照耀時(shí)，盡管靈敏度較低，但對(duì)DNA損害小，所以合適對(duì)DNA樣品的調(diào)查和收回等操作。300nm紫外線照耀的靈敏度較高，且對(duì)DNA損害不是很大，所以也對(duì)比適用。 #p#分頁標(biāo)題#e#
運(yùn)用溴化乙錠對(duì)DNA 樣品進(jìn)行染色，能夠在凝膠中參加終濃度為0.5μg/ml的EB。EB摻入DNA分子中，能夠在電泳過程中隨時(shí)調(diào)查核酸的搬遷狀況，可是假如要測(cè)定核酸分子巨細(xì)時(shí)，不宜運(yùn)用以上辦法，而是應(yīng)該在電泳完畢后，把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10～30min進(jìn)行染色。BE見光分解，應(yīng)在避光條件下4℃保留。 三、資料、試劑及用具 1、資料
ΛDNA/HindⅢ Marker（分子量規(guī)范）；試驗(yàn)37的質(zhì)粒提取物；試驗(yàn)39的酶切產(chǎn)品；試驗(yàn)40的銜接產(chǎn)品。 2、試劑
加樣緩沖液（6x）：0.25% 溴酚蘭，40%蔗糖；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）；酶液（10mg/ml）。 3、用具（1）電泳體系：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。 （2）紫外透射儀。 四、操作過程
1、按所別離的DNA分子的巨細(xì)規(guī)模，稱取適當(dāng)?shù)沫傊欠勰?，放到一錐形瓶中，參加適當(dāng)?shù)?.5×TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱**徹底溶化，溶液通明。稍搖勻，得膠液。冷卻**60℃擺布，在膠液內(nèi)參加適當(dāng)?shù)匿寤义V**濃度為0.5μg/ml。
2、取有機(jī)玻璃制膠板槽，有通明膠帶沿膠槽附近封嚴(yán)，并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽之間的縫隙。
3、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷**60℃擺布的膠液，使之構(gòu)成均勻水平的膠面。
4、.待膠凝結(jié)后，當(dāng)心拔起梳子，撕下通明膠帶，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。 5、在槽內(nèi)參加0.5×TBE 電泳緩沖液，**液面掩蓋過膠面
6、把待檢查的樣品，按以下量在潔凈載玻片上當(dāng)心混勻，用移液槍加**凝膠的加樣孔中。 1μl加樣緩沖液（6×）+5μl待測(cè)DNA樣品
〔+0.5μlEB 液（10mg/ml）（注：若膠內(nèi)未加EB，可選用此法）?！?nbsp;
7、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調(diào)理穩(wěn)壓輸出，電壓**高不超越5V/cm，開端電泳。點(diǎn)樣端放陰極端。依據(jù)經(jīng)歷調(diào)理電壓使分帶明晰。
8、調(diào)查溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動(dòng)。當(dāng)其移動(dòng)**距膠板前沿約1cm處，可中止電泳。 9、染色：把膠槽取出，當(dāng)心滑出膠塊，水平放置于一張保鮮膜或別的支持物上，放進(jìn)EB溶液中進(jìn)行染色，徹底浸泡約30min。
10、在紫外透視儀的樣品臺(tái)上從頭鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已染色的凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，翻開紫外燈（360nm或254nm），經(jīng)過調(diào)查孔進(jìn)行調(diào)查。 五、注意事項(xiàng)
1、電泳中運(yùn)用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì)，必須當(dāng)心，勿感染于衣物、肌膚、雙眼、口鼻等。一切操作均只能在專門的電泳區(qū)域操作，戴一次性手套，并及時(shí)更換。 2、預(yù)先參加EB時(shí)可能使 DNA的泳動(dòng)速度降低15%擺布，并且對(duì)不一樣構(gòu)型的DNA的影響程度不一樣。所認(rèn)為獲得較真實(shí)的電泳結(jié)果能夠在電泳完畢后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若膠內(nèi)或樣品內(nèi)已加EB，染色過程可省掉；若凝膠放置一段時(shí)間后才調(diào)查，即便原來膠內(nèi)或樣品已加EB，也主張?zhí)砑哟瞬健?nbsp;
3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要構(gòu)成氣泡，需在凝膠液未凝結(jié)之前及時(shí)鏟除，不然，需從頭制膠。4、以0.5×TBE作為電泳緩沖液時(shí)，溴酚蘭在0.5%～1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度大概相當(dāng)于300bp的線性DNA的泳動(dòng)速度，而二甲苯青 FF的泳動(dòng)速度相當(dāng)于4Kb的雙鏈線形DNA的泳動(dòng)速度。
