?3. 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15000～200000之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)值呈直線關(guān)系，符合下列方程：
若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。
儀器、原料和試劑
?儀器：垂直板型
電泳槽；直流穩(wěn)壓電源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴鍋，染色槽；燒杯；吸量管；常頭滴管等。
?原料：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)按照每種蛋白0.5~1mg·ml-1樣品溶解液配制?？膳渲瞥蓡我坏鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，也可配成混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。 ?試劑：
（1）分離膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液 PH8.9）:取1mol/L鹽酸48mL，Tris 36.3g,用無離子水溶解后定容**100mL。
（2）濃縮膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液 PH6.7）:取1mol/L鹽酸48mL, Tris 5.98g,用無離子水溶解后定容**100mL。
（3）30%分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，**后定容**100ml，過濾后置棕色試劑瓶中，4℃保存。 （4）10%濃縮膠貯液：稱Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，**后定容**100mL，過濾后置棕色試劑瓶中，4℃貯存。
（5）10%SDS溶液：SDS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解。 （6）1%TEMED；
(7）10%過硫酸銨（AP）：現(xiàn)用現(xiàn)配。
（8）電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3）:稱取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用無離子水溶解后定容**1L。
（9）樣品溶解液：取SDS 100mg，巰基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚藍2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸緩沖液0.5mL，加重蒸水**10mL（遇液體樣品濃度增加一倍配制）。用來溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測固體。
（10）染色液：0.25g考馬斯亮藍G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 （11）脫色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水與50mL甲醇混勻。 實驗步驟
?1． 安裝夾心式垂直板
電泳槽：目前，夾心式垂直板
電泳槽有很多型號，雖然設(shè)置略有不同，但主要結(jié)構(gòu)相同，且操作簡單，不易泄漏。同學(xué)們可根據(jù)具體不同型號要求進行操作。主要注意：安裝前，膠條、玻板、槽子都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。
?2．配膠：根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。本實驗采用SDS-PAGE不連續(xù)系統(tǒng)，按下表的配制分離膠和濃縮膠。 ?
重蒸餾水
11.87 10.20 8.54 5.20 4.60
混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min 10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05
?3．制備凝膠板：
（1）分離膠制備：按表配制20ml 10%分離膠，混勻后用細長頭滴管將凝膠液加**長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約3—4mm高，以進行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。
（2）濃縮膠的制備：按表配制10ml 3%濃縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直**距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合，再放置20—30min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。
?4．樣品處理及加樣
各標(biāo)準(zhǔn)蛋白及待測蛋白都用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹?.5~1mg/mL，沸水浴加熱3分鐘，冷卻**室溫備用。處理好的樣品液如經(jīng)長期存放，使用前應(yīng)在沸水浴中加熱1分鐘，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合。 #p#分頁標(biāo)題#e#
一般加樣體積為10－15μL（即2－10μg蛋白質(zhì)）。如樣品較稀，可增加加樣體積。用微量注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。
?5．電泳
將直流穩(wěn)壓
電泳儀開關(guān)打開，開始時將電流調(diào)**10mA。待樣品進入分離較時，將電流調(diào)**20－30 mA。當(dāng)藍色染料遷移**底部時，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片輕輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移**大培養(yǎng)皿中染色。
?6．染色及脫色
將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色1h左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白區(qū)帶清晰，即用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離。 計算
?1.相對遷移率mR =樣品遷移距離（cm）/染料遷移距離（cm）
?2.以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。 注意事項
?1. 不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出的分子量是不可靠的。包括：電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是35,000。因此，**好**少用兩種方法來測定未知樣品的分子量，互相驗證。
?2．有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-凝膠電泳的結(jié)果互相參照。
