A液：1mol/l Hcl 48.0 ml，Tris 36.4 克 ,TEMED 0.23 ml加水**100 ml pH 8.3。 B液：丙烯酰胺 28.0克 ；甲叉雙丙烯酰胺 0.735 克 加水**100 ml。 C液：過硫酸銨（用前配制）1.4 % 。 配膠：A：B：C：H2O = 1：2：0.4：4.6 配膠后立即灌好裝膠的玻璃管 3、點(diǎn)擊緩沖液配制
1、將各膠柱中酶帶條數(shù)、寬度、著色深淺和移動(dòng)距離填入表中。
3、選擇比較組分膠柱中、著色**深的酶帶或特殊酶帶（即該組分特有的酶帶），計(jì)算酶帶的相對(duì)遷移率Rf值 Rf=（某酶帶遷移距離）/（溴酚藍(lán)指示劑遷移距離） 六、
結(jié)果討論及分析
1、配制緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響：
在SDS-PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是PH6.7，分離膠PH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其PH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中PH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。
所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是**關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。 2、樣品的處理： #p#分頁標(biāo)題#e#
根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：
還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。
2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。
3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來使用。
3、SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用。
聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；
制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 4、提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑.
聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。
一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)》P82-103。 5.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？
主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 6. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？ 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直
電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。
處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 7.帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象可能原因。
主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。
處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。 8. 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？ 主要是樣品不溶性顆粒引起的。
處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 9. 什么是“鬼帶”，如何處理？
“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。
處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 10. 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。
處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。 11. 為什么電泳的條帶很粗？
電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。
處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓；
12. 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。
13. 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎？
這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。
14. 凝膠時(shí)間不對(duì)，或慢或快，怎么回事？
通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。 15. 電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng)？ #p#分頁標(biāo)題#e#
可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。 16.分離膠加上后為什么要立即加水？
加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。
