分離RNA時，良好的實驗室技術(shù)**關(guān)重要。與固定和神圣的DNA相比，RNA更不穩(wěn)定。具有核糖糖骨架的RNA含有高反應(yīng)性羥基（C-OH）基團(tuán)，確保鏈不斷制造，分解和重復(fù)使用。分離的RNA迅速降解，很容易被抗性酶核糖核酸酶（RNases）污染，這些核糖核酸酶隨處可見。
在本期Bench Bench中，我們采訪了舊金山加州科學(xué)院鳥類學(xué)和哺乳動物學(xué)系主任兼策展人Jack Dumbacher博士，了解他的實驗室目前的工作，即分離轉(zhuǎn)錄組和小RNA以鑒定宏基因組學(xué)病毒序列。與病毒作為病原體的典型觀點(diǎn)相反，病毒也可能與宿主具有共生關(guān)系或共生關(guān)系。了解鳥類中的這些進(jìn)化關(guān)系是Dumbacher的研究目標(biāo)之一。
“通常情況下，病毒顆粒是低豐度的RNA，”Dumbacher說。“核糖體RNA（rRNA）可能是你**初選擇的很大一部分。為了獲得良好的恢復(fù)，我們嘗試通過在田間采集大樣本并盡可能小心地保存它們來提高RNA產(chǎn)量。“
學(xué)院的收集探險通常發(fā)生在以生物多樣性而聞名的偏遠(yuǎn)地區(qū)，如熱帶森林或珊瑚礁。Dumbacher團(tuán)隊面臨的一大挑戰(zhàn)是，由于缺乏冷藏，無法用液氮快速冷凍樣品。（RNA在乙醇中穩(wěn)定降解，這是DNA樣品的常見防腐劑。）而是從鳥的泄殖腔（后消化道開口）擦拭樣品，放入RNA穩(wěn)定劑或含有4 M濃度的硫氰酸胍（GITC）緩沖液的其他混合物中。由于鹽含量，使用一些RNA穩(wěn)定劑可能難以在液體樣品中進(jìn)行RNA分離。保持冷藏鏈不是問題，
傳統(tǒng)上，GITC緩沖液已被用于裂解RNA提取中的細(xì)胞和病毒顆粒，并通過暫時使RNA變性來同時防止RNase酶活性。在這種情況下，必須在裂解前進(jìn)行一些完整的病毒分離樣過濾，以避免核酸湯。Dumbacher團(tuán)隊收集的樣品主要是液體形式 - 需要很少的均質(zhì)化，但良好的分離很重要。在現(xiàn)場，該團(tuán)隊使用0.2μ過濾器 - 類似于旋轉(zhuǎn)柱中的過濾器 - 來過濾較小的病毒顆粒。像完整細(xì)胞一樣留下較大的顆粒。其他實驗室使用冷凍組織樣本，必須快速徹底地均質(zhì)化以獲得良好的恢復(fù)。無論選擇何種方法，都會保留一定量的基因組（gDNA）。
在實驗室中，消除內(nèi)源和外源RNase與純化RNA之間的接觸始終是一個問題。在RNA純化過程的早期，RNase的外部來源不那么具有威脅性。但是，在RNA制劑不再受GITC溶液等變性劑的保護(hù)后，RNA被純化后，您需要避免激活RNases。蛋白質(zhì)RNase抑制劑可以隔離剩余的RNase，適用于大多數(shù)應(yīng)用，特別是那些含有內(nèi)源性RNase的應(yīng)用。作為預(yù)防措施，每當(dāng)觸摸設(shè)備時 - 應(yīng)更換玻璃器皿或移液器 - 手套。（用于RNA純化的玻璃器皿和器具的推薦培養(yǎng)時間在180°C**200°C時**少為4小時。）學(xué)院的比較基因組學(xué)實驗室盡可能使用DEPC處理過的水代替分子級水。DEPC水通過堿基的組氨酸修飾使RNase失活。當(dāng)在室內(nèi)制造水時，建議事先對DEPC水進(jìn)行高壓滅菌，以降解DEPC。
如果您尚未指定提取，請開始跟蹤。RNA產(chǎn)量因不同組織和樣品而有很大差異。對于Dumbacher，收集的每個樣品通常RNA含量都很低。獲得的RNA量取決于鳥類**后吃的時間，吃的東西，以及其他化學(xué)物質(zhì)或細(xì)菌是否在起作用。“即使我們使用RNA含量非常低的樣本，當(dāng)你構(gòu)建你的庫時，它會非常令人印象深刻，你會看到你在另一端獲得了多少序列，”Dumbacher說。（他的小組目前正在使用新一代測序技術(shù)來分離病毒序列。）
為了增加（先前RNA強(qiáng)健的）組織樣品中的RNA產(chǎn)量，避免過度均質(zhì)化或加熱。以30秒的休息間隔以30秒的脈沖均質(zhì)化可以改善RNA回收。此外，使用二氧化硅旋轉(zhuǎn)過濾器時，用更多的水洗脫會從膜中釋放出更多的RNA。無論您的實驗室使用何種下游技術(shù)，成功的分析都依賴于良好的RNA分離技術(shù)。實踐是**的。快樂解壓！
