DNA測序可以看作是三種技術(shù)或步驟的組合:
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步驟1:通常通過基于PCR的技術(shù)生成DNA片段
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步驟2:通過毛細(xì)管或常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離片段
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步驟3:檢測步驟,最常見的是熒光檢測。
水質(zhì)對每個(gè)步驟的影響將在單獨(dú)的部分中介紹。
這里簡要介紹了水質(zhì)的影響。用于操作DNA測序儀的水質(zhì)應(yīng)符合某些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以優(yōu)化測序過程。
無核酸酶的水
建議使用無核酸酶的水,以避免在DNA測序的所有步驟中DNA降解。使用超濾設(shè)備可以有效地去除核酸酶(請參閱無RNase的水部分)。使用點(diǎn)超濾濾芯可以安裝在凈水系統(tǒng)的出口,以根據(jù)需要提供無核酸酶的水。
有機(jī)物
有機(jī)物是DNA測序中最具破壞性的污染物。實(shí)際上,有機(jī)物的高負(fù)載會損害毛細(xì)管內(nèi)部或較大凝膠中的凝膠電泳過程。天然物質(zhì)降解產(chǎn)生的大型有機(jī)酸,例如腐殖酸和富里酸,在電泳過程中可能與DNA片段共洗脫,并且在PCR步驟中也會干擾聚合酶的效率。另外,更常見的是,某些有機(jī)物會干擾熒光檢測并導(dǎo)致所分析目標(biāo)DNA測序的錯誤。實(shí)際上,大多數(shù)測序技術(shù)都是基于對附著在DNA片段上的熒光染料的檢測。熒光吸收和猝滅有機(jī)分子的存在會干擾檢測。
為了確保用于DNA測序的高純水的有機(jī)純度,建議使用總有機(jī)碳含量較低的有機(jī)碳,即總有機(jī)碳(TOC)。在高純水凈化系統(tǒng)中,TOC的規(guī)格<5 ppb(µg / L)。
離子
在PCR步驟中,需要仔細(xì)調(diào)節(jié)某些離子(例如鎂)的含量,以優(yōu)化聚合酶的效率。必須除去其他離子,鎘和一些其他二價(jià)陽離子,以防止抑制聚合酶。當(dāng)所用的水具有高純度且不包含未知濃度的離子時(shí),也可以最好地獲得和控制電泳過程中所需的離子力。
高電阻率(18.2MΩ•cm)確保水中的離子含量低(總離子濃度低于1 µg / L)。高純度水凈化系統(tǒng)旨在按需提供連續(xù)的高電阻率水。
細(xì)菌
細(xì)菌可以在水中釋放核酸酶,因此,應(yīng)將其去除以避免核酸降解。細(xì)菌還會釋放出可能干擾目標(biāo)DNA片段電泳分離的DNA。另外,如前所述,細(xì)菌會釋放離子和有機(jī)物,這兩種污染物都會干擾DNA測序。
通過在整個(gè)凈化過程中結(jié)合技術(shù)和維護(hù)建議,可以使用水凈化系統(tǒng)控制細(xì)菌的水平。膜技術(shù),絕對微濾或超濾為0.2 µm,可在交貨時(shí)去除細(xì)菌,并確保細(xì)菌水平<0.1 cfu / mL。254 nm的殺菌紫外線。
總體而言,在測序步驟中,水質(zhì)應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn):
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無核酸酶
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高電阻率(18.2MΩ•cm)
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有機(jī)物含量低(TOC <5 ppb)
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低細(xì)菌數(shù)(<1 cfu / mL)
DNA測序儀制造商還使用水來制備毛細(xì)管。水質(zhì)對于該步驟很重要,盡管科學(xué)家在購買設(shè)備時(shí)對毛細(xì)管制備沒有太多控制。