題記：本文轉(zhuǎn)載自丁香園論壇熱貼：“窮人的勞斯萊斯”，作者seagate分享了他在從2005年**次見(jiàn)到抗體到2010年間五年western blot的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷。五年里，太多的磨難，太多的驚喜，太多的感觸，太多的代價(jià)，讓seagate對(duì)于western blot實(shí)驗(yàn)有了獨(dú)到深刻的見(jiàn)識(shí)。因?yàn)檎搲虐娌患?，轉(zhuǎn)載全文**此，以饗各位網(wǎng)友。再次向丁香園網(wǎng)友seagate致以誠(chéng)摯的謝意。

1、抗體的選擇

    　對(duì)于國(guó)內(nèi)的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室來(lái)講，做western blot實(shí)驗(yàn)選擇抗體是個(gè)頭疼的問(wèn)題。原因很簡(jiǎn)單，買(mǎi)進(jìn)口抗體捉襟見(jiàn)肘，買(mǎi)國(guó)產(chǎn)抗體得需要大無(wú)畏的勇氣，對(duì)于我所在的蘭州地區(qū)的實(shí)驗(yàn)者而言，感觸尤深。在這五年的western blot實(shí)驗(yàn)歷程里，我先后用過(guò)進(jìn)口抗體，進(jìn)口抗體國(guó)內(nèi)分裝包裝，國(guó)產(chǎn)抗體，質(zhì)量良莠不齊。

    　進(jìn)口抗體一般不會(huì)出現(xiàn)閃失：abcam品種全，質(zhì)量過(guò)硬，但價(jià)高（3400元/100微升），而且說(shuō)是100微升，但**多能吸出來(lái)90微升；Sigma的價(jià)**貴；比較有性價(jià)比的是CST的抗體，現(xiàn)在好像是2200元/100微升，我前后用過(guò)二十幾種， 1:1000的稀釋比下，還沒(méi)有失過(guò)手，100微升通常能完成所有的免疫組化和western blot實(shí)驗(yàn)，還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通常量比100微升多出來(lái)10微升，**的不足是CST的品種實(shí)在不多。Santa的多克隆抗體質(zhì)量可以，但是選用Santa的單抗還是有風(fēng)險(xiǎn)，估計(jì)這也是業(yè)界共識(shí)了吧。

   　 進(jìn)口抗體國(guó)內(nèi)分裝包裝我也用過(guò)不少，呵呵，畢竟是窮人（420元/100微升），大概好抗體的比例約為50%，如果能做出來(lái)，也存在一個(gè)問(wèn)題，就是抗體大多只能用一次。我曾經(jīng)把Santa的原裝抗體和分裝抗體做過(guò)比對(duì)（抗體品種，貨號(hào)等完全一致），在都能做出來(lái)的前提下，原裝抗體能重復(fù)使用的次數(shù)要多出許多。具體原因我已經(jīng)揣測(cè)了好幾年，不敢說(shuō)出來(lái)，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整個(gè)賣(mài)，也會(huì)有所不同。揣測(cè)歸揣測(cè)，假如只為了發(fā)論文畢業(yè)走人，可以考慮選用進(jìn)口分裝的多克隆抗體。

    　國(guó)產(chǎn)抗體比較知名的就幾家，但質(zhì)量確實(shí)不敢恭維。western blot能做出來(lái)的確實(shí)不多，而且雜帶多，背景不干凈。我們周邊的實(shí)驗(yàn)室大多買(mǎi)國(guó)產(chǎn)抗體做免疫組化，怎么說(shuō)呢，應(yīng)付碩士論文夠了。

    　我也幫別人自制過(guò)抗體，再用抗原親和純化。效價(jià)非常不錯(cuò)，夸張的時(shí)候1：10000都能做出條帶，**的麻煩是兔子太騷（騷臭），不知道這是不是“兔女郎”名號(hào)的來(lái)由。如果讀書(shū)非常悠閑，老板又特別想擁有手工作坊的情況下，可以自己伺候折騰兔子來(lái)玩玩，剛開(kāi)始的時(shí)候還是蠻有成就感的。只是單憑抗原表達(dá)和制備多抗，是不是可以寫(xiě)成論文畢業(yè)，估計(jì)因校而異了。

    　2、Western Blot設(shè)備

    　目前**好的垂直槽和轉(zhuǎn)移槽還是Biorad（伯樂(lè)），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四塊膠，但通常用不上，由此造成垂直緩沖液的浪費(fèi)，而且MINI4用綠色塑料夾住玻璃板來(lái)組成內(nèi)槽，容易漏液，塑料夾應(yīng)該是有疲勞壽命的，估計(jì)日子一長(zhǎng)，彈性就會(huì)改變，所以如果你們實(shí)驗(yàn)室剛買(mǎi)了MINI4，趕緊用，遭殃的肯定是某一級(jí)的師弟師妹們。

    　Biorad的一套系統(tǒng)得兩萬(wàn)多，西部能玩得起伯樂(lè)的還真不多。好在咱中國(guó)人聰明，上海天能的外觀和構(gòu)造和伯樂(lè)的MINI3幾乎一模一樣，而且可以通用，不帶電泳儀是5千多一套，挺好用的。**的不足是塑料壽命不如伯樂(lè)，膠架容易斷裂。不過(guò)仔細(xì)算算，三套天能也就是一套伯樂(lè)的價(jià)格，值了。北京六一的垂直槽很轉(zhuǎn)移槽很好用，但垂直槽配膠不方便，玻板太厚，散熱不好，但能用，六一的電泳儀（電源）還是很好用的。

   　 3、Western Blot實(shí)驗(yàn)條件

   　 Western Blot實(shí)驗(yàn)條件我基本是按ABCAM公司經(jīng)典教材做的，按以下的網(wǎng)址下載下來(lái)就可以了（http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。具體的試劑配方我是按寶生物試劑冊(cè)的附錄部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是從北京華美買(mǎi)的德國(guó)biomol原裝貨，配出來(lái)的膠可以提在手里玩，彈性非常好，價(jià)格比sigma的便宜許多，1公斤好像是480多人民幣，夠?qū)嶒?yàn)室用好長(zhǎng)時(shí)間，現(xiàn)在我們實(shí)驗(yàn)室做雙向電泳都用biomol的膠，很好用。Marker我現(xiàn)在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了，蘭州的代理是上海生工。

    　要強(qiáng)調(diào)的是垂直電泳緩沖液千萬(wàn)不能回收用，具體愿因你只需上網(wǎng)查查SDS-PAGE的原理就知道了。轉(zhuǎn)移電泳緩沖液可以回收再用兩次。

    　轉(zhuǎn)膜我通常是快轉(zhuǎn)兩百200毫安/2小時(shí)，慢轉(zhuǎn)80毫安/12小時(shí)?？燹D(zhuǎn)是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。

    　封閉我通常用BD的脫脂奶粉，不歸，260元500克，也是從北京華美買(mǎi)的。

    　ECL我用pierce的，500毫升1650元，比國(guó)產(chǎn)的還便宜好用。

    　膠片是柯達(dá)的，以前用過(guò)樂(lè)凱的，不如柯達(dá)。

    　我很少用麗春紅或考馬斯染膜或染膠，總覺(jué)得是脫褲子***的事。