1.  在western實(shí)驗(yàn)中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么區(qū)別？

答：選擇合適的緩沖液對(duì)于維持一定PH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性是很重要的。PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS（因?yàn)榛旌暇彌_液在一定的離子強(qiáng)度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在pH7.0以下緩沖能力較弱（不過PBS易污染）。但我們常常要根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽離子緩沖液**TBS；陽離子交換層析時(shí)，陰離子緩沖液則**PBS。

western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。

2.  沒有注明可以用來做western blot的一抗，可以用來做western blot嗎？

答：不一定，因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于western blotting，因?yàn)樵趙estern blotting中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。

 

3.  做western每次只加一種一抗，可以同時(shí)加兩種或者多種一抗的嗎？

答：**好還是不要同時(shí)加兩種一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號(hào)的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對(duì)照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對(duì)照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。

 

4.  western blot 使用的膜哪種**好啊，PVDF好還是NC膜，如何選擇？

答：PVDF膜價(jià)格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。 NC膜價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關(guān)文獻(xiàn)。

 

5.  為什么出現(xiàn)了多條帶，每個(gè)加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律，為什么？是封閉時(shí)間不夠嗎？做WESTERN必須要內(nèi)參嗎？

答：一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)，抗體的特異性不強(qiáng)，目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化，而內(nèi)參的條帶基本均勻一致。這樣才有說服力，表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化，所以嚴(yán)格意義上說，內(nèi)參是必須做的。

6.  western用的一抗，單抗好些還是用多抗好些？用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？

答：作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價(jià)格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。

做免疫印跡時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問題，一是所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印**膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。

 

7.  半干轉(zhuǎn)是否要求膜，濾紙，膠同樣大??？因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？

答：可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， **后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5~3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。

8.  Western Blot哪種染色好？

答：（1） 陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達(dá)到1.5 μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。

（2） 膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級(jí)，但染色比穩(wěn)定。

（3） 生物素化靈敏度位于1~2之間，可用于任何一種膜。

9.  不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）（優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低**6%。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓/電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

 

10.  DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？

答：DAB顯色在辣根過氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。

 

11.  酶顯色與熒光顯色之間，各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

答：免疫酶技術(shù)就是用酶(如辣根過氧化物酶)標(biāo)記已知抗體（或抗原），然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原（或抗體），抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時(shí)，能催化底物水解、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，這樣就可以識(shí)別出標(biāo)本抗原（抗體）分布的位置和性質(zhì)，通過圖像分析并可達(dá)到定量的目的。

免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷，但是熒光抗體染色標(biāo)本不能長期保存，對(duì)組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，免疫酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法，對(duì)石蠟切片標(biāo)本尤為適用，為免疫病理研究開辟了一條新途徑，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過適當(dāng)處理還可以進(jìn)行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù)，前者是將酶通過交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進(jìn)行的免疫反應(yīng)，稱為非標(biāo)記抗體酶技術(shù)。