1.  凝膠腫脹或卷曲

注意轉(zhuǎn)膜之前，切割下來的凝膠一定要在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡平衡5-10分鐘，要含有20%的甲醇。

2.  條帶歪斜、或漂移

因?yàn)檗D(zhuǎn)膜儀使用時(shí)間太長(zhǎng)，兩塊板之間的海綿由于長(zhǎng)期使用變得很薄。當(dāng)按照陰極-海棉-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿依次放好后兩塊板不能壓緊，因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙，電轉(zhuǎn)移時(shí)蛋白從膠和膜之間的空隙中流走，形成如圖所示的形狀。使用十幾張普通的草紙墊在兩塊海棉之間，條帶就可以變得非常的漂亮。

另外，轉(zhuǎn)膜時(shí)轉(zhuǎn)膜液一定要浸沒凝膠和膜，否則也可能出現(xiàn)上述情況。

3.  單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)

轉(zhuǎn)膜時(shí)在膜與膠之間有氣泡。做三明治時(shí)一定要逐層壓緊，趕盡氣泡。同時(shí)轉(zhuǎn)膜液要提前配置好，加好甲醇，保證轉(zhuǎn)膜前夜體內(nèi)氣泡排凈。氣泡存在的局部會(huì)抵抗蛋白轉(zhuǎn)膜，降低轉(zhuǎn)膜效率。

4.  轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱

緩沖液離子強(qiáng)度太低，或電壓及電流過高。按照上述方式配液，同時(shí)轉(zhuǎn)膜過程中注意降溫。我在冰水混合物中轉(zhuǎn)膜，效果很好。

5.  背景過高

（1）封閉不全，我用5%-10%的光明脫脂奶粉，效果還可以，現(xiàn)在做基本上沒什么背景。如果你覺得不夠可以加點(diǎn)BS，1%吧。

（2）一抗或者是封閉液與膜蛋白的交叉反應(yīng)。這種情況通?？梢酝ㄟ^加入TWEEN-20或多次洗膜加以解決。如果問題不能解決，那么降低一抗?jié)舛?，或更換封閉液種類可能解決。

（3）一抗二抗中某些不純的物質(zhì)也可以造成背景。

（4）抗體濃度太高，或孵育時(shí)間太常都可能遇到這種情況。那么可以適當(dāng)降低一抗二抗的濃度，或是用提高溫度的方式來代替雜交時(shí)間的延長(zhǎng)；另外，少量多次得洗膜效果要優(yōu)于多量而長(zhǎng)時(shí)間得洗膜效果。

（5）曝光時(shí)間的控制。通常我們線曝光一分鐘試試，條帶清晰背景也強(qiáng)，可以縮短曝光時(shí)間，或者過一段時(shí)間等熒光減弱以后再發(fā)光，一般也可以發(fā)出比較好的條帶。如果背景強(qiáng)于條帶，那么肯定是前面默默個(gè)原因的一種，這是可以將膜在TBST中漂洗以下再發(fā)光，有時(shí)會(huì)有比較好的效果（僅限于國(guó)外較好的試劑盒，國(guó)產(chǎn)的不行，洗一下啥也沒了?。┻@個(gè)時(shí)候可以洗膜，洗膜后重新發(fā)光。

6.  沒有信號(hào)

（1）用單抗時(shí)比較容易出現(xiàn)這種情況。因?yàn)閱慰怪饕轻槍?duì)天然蛋白，這個(gè)時(shí)候，TWEEN-20的作用就顯現(xiàn)出來了，它可以增加抗原抗體復(fù)合物與膜的結(jié)合。

（2）確信你的蛋白表達(dá)。

（3）確信蛋白高效的轉(zhuǎn)移到你的膜上。

（4）一抗二抗的效價(jià)問題。無論哪個(gè)無效都不能發(fā)光，因此預(yù)實(shí)驗(yàn)一定要從**低的稀釋度開始，以排除抗體的因素。

（5）ECL試劑盒質(zhì)量的問題，不可小覷。偶親身經(jīng)歷。碰到一批次品。兩個(gè)月白搭！

7.  微量進(jìn)樣器堵了怎么辦

首先從預(yù)防入手，每次用后的進(jìn)樣器及時(shí)用蒸餾水清洗！

如果堵了，不要緊，有辦法：可以用如下辦法解決：

（1）首先反復(fù)推拉上樣針，看是否可將堵塞物吹出來；

（2）方法1不靈，若是25或50 ul 的針，把針從后側(cè)拔出，然后重新插入，使其內(nèi)部產(chǎn)生氣壓，可能壓出堵塞物質(zhì)；

（3）如上述方法不靈可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水壓排出；

（4）**后的方法，**靈的方法：開始步驟同第3種方法中，在加入水后，將上樣器的前端針部放在酒精燈上煅燒**紅色（估計(jì)在什么位置堵的），注意 燒紅部分不要距離玻璃過近，然后，趁熱突然推針，將水強(qiáng)行推出，通道打開后，再通過稀酸或稀堿沖洗即可！

（5）或者放在超聲清洗儀里，超聲試試 

注意，切記在推拉過程中小心不要把針弄彎

8.  關(guān)于SDS蛋白電泳的一點(diǎn)心得 

（1）蛋白電泳中出現(xiàn)的縱向條帶：原因主要是由于電泳樣品或是電極緩沖液中有沒有溶解的樣品顆粒所致，上樣前充分將樣品離心，或重新使用新配電極緩沖液即可解決。

（2）電泳條帶前沿在染色脫色后呈尖形。原因是由于上樣量大且工作電壓過大引起，實(shí)驗(yàn)中采用90/120，后來改用了80并且不換電壓；同時(shí)減少上樣量到原來的一半，得到了滿意的結(jié)果（樣品分子量18 000 Da，15%的分離膠）；

（3）電泳結(jié)束后，染色脫色結(jié)果整個(gè)膠面呈現(xiàn)藍(lán)色，背景很重 怎么也脫不去，改用新配的電極緩沖液。問題解決，是電極緩沖液污染的結(jié)果（壞毛病：喜歡在緩沖液中涮上樣針，導(dǎo)致緩沖液污染 ）。