Western 免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。

 

為利于更好的實(shí)驗(yàn)效果，不同蛋白，轉(zhuǎn)膜條件略有不同，今天跟各位同學(xué)一起分享下實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的不同蛋白的轉(zhuǎn)膜條件。

 

蛋白來源：RAW264.7 總蛋白

蛋白名稱：一些轉(zhuǎn)錄因子

蛋白分子量：40~70 KD

WB 用膜類型、孔徑：0.45 NC

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒流 400 mA

轉(zhuǎn)膜時間：60~90 min

PS. 其實(shí)吧，以我的經(jīng)驗(yàn)來看，除非目的蛋白特別小，或者特別大，不然轉(zhuǎn)膜時間真的不是那么重要， 曾經(jīng)因?yàn)槭д`，轉(zhuǎn)了 15 min 就拆下來了，但從麗春紅染色來看，跟平常實(shí)驗(yàn)也沒有太大的區(qū)別。

 

蛋白來源：內(nèi)皮細(xì)胞 總蛋白

蛋白名稱：occludin & AKT

蛋白分子量：65 KD & 56 KD

WB 用膜類型、孔徑：0.45 PVDF

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒壓 100 V

轉(zhuǎn)膜時間：60~70 min

設(shè)備名字是「Bio-Rad mini」。

 

蛋白來源：腫瘤手術(shù)標(biāo)本

蛋白名稱：轉(zhuǎn)錄因子

蛋白分子量：33 KDa

WB 用膜類型、孔徑：PVDF 膜

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：350 mA 恒流

轉(zhuǎn)膜時間：150 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad

說明：相同條件曾用于數(shù)個 30-70 KDa 的蛋白，都能成功轉(zhuǎn)上，不過沒有試縮短時間效果如何； 實(shí)驗(yàn)時沒為轉(zhuǎn)膜條件苦惱，倒是電泳時膠的濃度及時間根據(jù)不同分子量而有區(qū)別。

 

蛋白來源：成纖維細(xì)胞

蛋白名稱：smad3

蛋白分子量：54 KDa

WB 用膜類型、孔徑：PVDF 膜

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：350 mA 恒流

轉(zhuǎn)膜時間：150 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad 

蛋白來源：腫瘤細(xì)胞

蛋白名稱：磷酸化蛋白

蛋白分子量：10-200 KDa

WB 用膜類型、孔徑：millipore PVDF 膜 0.45 um

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：120 v 恒壓

轉(zhuǎn)膜時間：120 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備：濕轉(zhuǎn) Bio-Rad

建議：轉(zhuǎn)膜緩沖液只用 2 次，基本都轉(zhuǎn)上，5%BSA 封閉，減少背景。

 

蛋白來源：Hepg2

蛋白名稱：EGFR

蛋白分子量：170kd

WB 用膜類型、孔徑：pvdf 0.45

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：24V

轉(zhuǎn)膜時間：2 個半小時

轉(zhuǎn)膜設(shè)備：伯樂半干轉(zhuǎn)

 

蛋白來源：肝癌細(xì)胞

蛋白名稱：HIF-1α

蛋白分子量：120 kD

WB 用膜類型、孔徑：NC 膜

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓）：80 伏，濕轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)膜時間：150 分鐘

設(shè)備：「Bio-Rad mini」

建 議：濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜液特別重要，否則會導(dǎo)致電壓或者電流不穩(wěn)影響轉(zhuǎn)膜條帶。轉(zhuǎn)膜均現(xiàn)配先用，不重復(fù)利用。轉(zhuǎn)膜時間一般是 150 分鐘，80 伏恒壓。經(jīng)李春紅染 色，靠近蛋白膠的一側(cè)膜上蛋白染色深，膜另外一面染色淺，說明蛋白未轉(zhuǎn)過。該濕轉(zhuǎn)條件自己做過的蛋白分子量范圍：170-36 kD。

 

 

蛋白來源：肺臟

蛋白名稱：ICAM-1

蛋白分子量：85~110 KD

WB 用膜類型、孔徑：0.22NC

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒流 300 mA

轉(zhuǎn)膜時間：120 min

設(shè)備名字 Bio-Rad mini

一抗用的 santa cruz 1 mL 包裝的。 比例調(diào)整到 1：800 做出很好的條帶。 效價會一直降低的。去年做的這個指標(biāo)，今年夏天做就不行了。

 

蛋白來源：人腫瘤細(xì)胞

蛋白名稱：磷酸化蛋白

蛋白分子量：30-60 KDa

WB 用膜類型、孔徑：pall NC 膜 0.45 um

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜

轉(zhuǎn)膜時間：60-90 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 北京六一 半干轉(zhuǎn)

建議：轉(zhuǎn)膜緩沖液用新鮮配制的，可先配成 2 倍的母液，轉(zhuǎn)膜液的多少會影響電轉(zhuǎn)的效率，一般將吸水紙潤濕即可，不要和膜一起浸泡，這樣效果很好。

 

蛋白來源：人肝癌腫瘤細(xì)胞

蛋白名稱：notch

蛋白分子量：60-120 KDa

WB 用膜類型、孔徑：pall NC 膜 0.45 um

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：恒流 0.3 A

轉(zhuǎn)膜時間：-20 度冰柜 120 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 濕轉(zhuǎn) Bio-Rad

建議：轉(zhuǎn)膜緩沖液用新鮮配制的，可先配成 10 倍或 5 倍的母液，保持低溫是轉(zhuǎn)膜效果的一個保證，這樣效果很好。

 

蛋白來源：肺臟、肝臟等。

蛋白名稱：actin

蛋白分子量：43 kD

WB 用膜類型、孔徑：NC 膜 PALL 0.22 um

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒流 200 mA

轉(zhuǎn)膜時間：45~60 min

設(shè)備名字 Bio-Rad mini

用的 santa cruz 分裝和整裝的都可以。效價一般 1：1000-1：3000 左右，可穩(wěn)定較長一段時間。

 

蛋白來源：細(xì)菌蛋白

蛋白名稱：全部的可溶性蛋白

蛋白分子量：11-170 KD

WB 用膜類型、孔徑：0.45 NC

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒流 300 mA

轉(zhuǎn)膜時間：80 min

 

蛋白來源：骨肉瘤 CELL LINE

蛋白名稱：Beta actin

蛋白分子量：42 kDa

WB 用膜類型、孔徑：Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn)，恒壓 22 v

轉(zhuǎn)膜時間：90 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備：X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)

建議改進(jìn)方向：轉(zhuǎn)膜過程冰水浴，保持低溫，Transfer Buffer 重復(fù)使用。

  

蛋白來源：腎瘤細(xì)胞

蛋白分子量：39 kDa

WB 用膜類型、孔徑：Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒壓 100 v

轉(zhuǎn)膜時間：50 min

 

蛋白來源：pichia 分泌表達(dá)

蛋白名稱：細(xì)胞因子等

蛋白分子量：17 到 30 kDa

WB 用膜類型、孔徑：millipore PVDF 0.45 um

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒壓：100 V

轉(zhuǎn)膜時間：60 min

這個條件除了 100 KDa 的預(yù)染 maker 轉(zhuǎn)的不好，剩下的條帶都非常清晰。正向前面 ycwzq 說的，感覺時間不是很重要，只要蛋白別太小或太大，在一個比較寬的時間和電壓范圍都能轉(zhuǎn)上。當(dāng)然這些還有一個重要的影響因素就是所用的蛋白轉(zhuǎn)印緩沖液。 

   

蛋白來源：小鼠前列腺癌細(xì)胞

蛋白名稱：P53 P21 RAD51 GAPDH

蛋白分子量：53 KDa、21 KDa、37 KDa、36 KDa

WB 用膜類型、孔徑：PVDF 膜 0.45

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：恒壓 110 v

轉(zhuǎn)膜時間：60 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 濕轉(zhuǎn) Bio-Rad mini

 

蛋白來源： 來自 MDCK 增殖的流感病毒裂解物

蛋白名稱：PB1

蛋白分子量： 96 kd（注意，10% SDS-PAGE，冰上電泳。用預(yù)染 marker 觀察 100kd 的條帶跑到膠的正中間位置時，才開始轉(zhuǎn)膜，否則轉(zhuǎn)膜效率降低）

WB 用膜類型、孔徑： NC 膜， 0.45

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：恒壓，100V

轉(zhuǎn)膜時間： 2 hours

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: BIO-rad 轉(zhuǎn)膜設(shè)備。其間，準(zhǔn)備一個冰盒，將電泳槽半埋到冰里。

轉(zhuǎn)膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加 SDS 以及多大質(zhì)量濃度等）： 2.9 g 甘氨酸，5.8 g tris，0.37 g SDS，200 ml 甲醇。

 

蛋白來源： 軟骨細(xì)胞

蛋白名稱：b-actin

蛋白分子量： 43 kd

WB 用膜類型、孔徑： PVDF 膜， 0.45

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn)，恒流，350 mA

轉(zhuǎn)膜時間： 85 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: BIO-rad 轉(zhuǎn)膜設(shè)備。其間，準(zhǔn)備一個冰盒，將電泳槽半埋到冰里。

轉(zhuǎn)膜液的配制：（2.92 g 甘氨酸，5.8 g tris，0.375 g SDS，200 ml 甲醇，用雙蒸水定容到 1 L）

 

蛋白來源：HepG2 細(xì)胞

蛋白名稱：Akt 及 P-Akt

蛋白分子量：55KDa/56KD

WB 用膜類型、孔徑：PVDF 膜 0.45 孔徑

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：100V 恒壓

轉(zhuǎn)膜時間：75 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 濕轉(zhuǎn) Bio-Rad

 

蛋白來源：大鼠

蛋白名稱：Bactin（42 KDa）

WB 用膜類型、孔徑：PVDF（0.45）膜

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：濕轉(zhuǎn) 恒流 150 mA

轉(zhuǎn)膜時間：100 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: 北京六一

 

蛋白來源： 大鼠大腦皮質(zhì)

蛋白名稱：b-actin

蛋白分子量： 43 kd

WB 用膜類型、孔徑： PVDF 膜， 0.45

轉(zhuǎn)膜方式（恒壓、恒流）：半干轉(zhuǎn)，恒流，2 mA/cm2

轉(zhuǎn)膜時間： 8-55 min

轉(zhuǎn)膜設(shè)備: BIO-rad 轉(zhuǎn)膜設(shè)備。

轉(zhuǎn)膜液的配制：（2.92 g 甘氨酸，5.8 g tris，0.375 gSDS，200 ml 甲醇，用雙蒸水定容到 1 L）