Western Blot 又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應(yīng)的一種定量或定性檢測蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。
其基本原理為：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標(biāo)蛋白，通過酶促反應(yīng)或者化學(xué)發(fā)光等方法將目標(biāo)蛋白可視化，從而對蛋白進(jìn)行定性或者定量研究。
抗體與抗原之間的特異性識別是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中**為關(guān)鍵的一個步驟，選擇的抗體是否合適、抗體的質(zhì)量優(yōu)劣都關(guān)乎實(shí)驗(yàn)的成敗。下面將從高品質(zhì)抗體的選擇、驗(yàn)證數(shù)據(jù)對抗體的重要性及內(nèi)參抗體的選擇標(biāo)準(zhǔn)等方面給大家一些建議。
質(zhì)量是甄選優(yōu)質(zhì)抗體的首要標(biāo)準(zhǔn)
2015 年，刊登在 Nature 的一篇文章深度闡述了目前抗體試劑的現(xiàn)狀與問題，給全世界科研工作者敲響了警鐘。當(dāng)抗體試劑遭遇信任危機(jī)，我們更應(yīng)深刻反思：如何才能獲得高質(zhì)量、合適的抗體試劑。（查看全文）
市面上常見的抗體有進(jìn)口品牌、國產(chǎn)品牌、進(jìn)口品牌國內(nèi)分裝這幾種類型。大部分進(jìn)口品牌在抗體的質(zhì)量、特異性、效價及保存條件方面較有保障。而有些國產(chǎn)品牌的抗體，在做 Western Blot 時，由于其特異性不高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)背景不干凈，非特異性條帶多等問題。進(jìn)口品牌國內(nèi)分裝則是個別經(jīng)銷商從廠家買到產(chǎn)品后，再通過稀釋、分裝、重新貼牌之后賣給客戶，這樣的抗體雖然價格相對便宜，但質(zhì)量良莠不齊，批間差異較大。
要確?？贵w的高質(zhì)量，我們通常是選擇可信賴的品牌，此外，還應(yīng)注意抗體的供應(yīng)商渠道是否正規(guī)，其供應(yīng)鏈物流是否專業(yè)。綜合這幾方面因素，Sigma-Aldrich 都是不錯的選擇。Sigma-Aldrich 是國內(nèi)**早實(shí)行電子商務(wù)的生命科學(xué)產(chǎn)品供應(yīng)商，并以直銷為主導(dǎo)，避免了中間流通環(huán)節(jié)的問題，加上其強(qiáng)大的物流體系，很大程度上降低了銷售環(huán)節(jié)可能帶來的實(shí)驗(yàn)風(fēng)險。
完善的驗(yàn)證數(shù)據(jù)是抗體選擇的必要參考
優(yōu)質(zhì)抗體還應(yīng)具備完善的驗(yàn)證數(shù)據(jù)和詳細(xì)的信息標(biāo)注，比如：是否明確標(biāo)注其可以用于 Western Blot、是否有足夠的數(shù)據(jù)支持證明該抗體適用于某一組織或者樣本、是否有明確的抗體建議稀釋濃度、該抗體的識別位點(diǎn)是連續(xù)的氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)還是非連續(xù)性氨基酸的三維結(jié)構(gòu)位點(diǎn)……這些信息和數(shù)據(jù)的真實(shí)性及完整性是保證 Western Blot 實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。
關(guān)于這一點(diǎn)，HPA 金標(biāo)抗體及其所提供的數(shù)據(jù)是一個很好的案例。HPA 抗體數(shù)據(jù)庫覆蓋了人類 85% 的蛋白，每支抗體均通過嚴(yán)格的抗原序列篩選及親和層析純化流程，確保其特異性和純度。此外，每支抗體在多種組織樣品中經(jīng)過蛋白芯片、Western Blot、免疫組化、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，并獲得學(xué)術(shù)委員會的認(rèn)證。作為重要的參考數(shù)據(jù)，所有的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、發(fā)表文獻(xiàn)和生物信息學(xué)預(yù)測都公布在 proteinatlas.org 網(wǎng)站供大家免費(fèi)查詢。完善的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持可避免因信息不完整而造成的選擇錯誤。
有效的內(nèi)參抗體是實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確的重要憑證
在 Western Blot 中，內(nèi)參是由持家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins），在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用來做參照物。借助內(nèi)參校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，是證明 Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠的重要憑證。一些常見的內(nèi)參基因及抗體包括 β-actin、GAPDH、PCNA、α-Tubulin 等。
值得注意的是，不同的內(nèi)參抗體只適用于一定范圍的樣本和組織，我們需要查閱參考文獻(xiàn)，并根據(jù)樣本和組織的差別選擇合適的內(nèi)參抗體，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。（如下表所示）
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內(nèi)參抗體選擇標(biāo)準(zhǔn) |
參考依據(jù)（貨號為 Sigma 公司推薦） |
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根據(jù)目的蛋白種屬來源 |
哺乳動物：GAPDH（G8795）、β-actin（A5441）、β-tublin（T2200） |
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植物：Plant actin（A0480）、Rubisco（R8000） |
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目的蛋白分子量大小 |
一般同內(nèi)參相差5kDa |
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目的蛋白的定位 |
核定位蛋白：Lamin B（L9393）、TBP、Histone H3（H9289），PCNA（WH0005111M2） |
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膜定位蛋白：Na/K ATPase（A276） |
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線粒體定位蛋白：VDAC1/膜孔蛋白（AV35122） 、COX IV |
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胞質(zhì)定位蛋白：GAPDH、β-actin、β-tublin （同樣適用于全細(xì)胞樣品檢測） |
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特異性及具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/td>
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β-actin 在肌肉組織中含量很少 |
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細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，c-Jun 由于自身表達(dá)變化就不適合做內(nèi)參 |
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凋亡檢測時，不適宜選擇LaminB、TBP 等作為內(nèi)參 |
在 Western Blot 中如果抗體選擇或使用不當(dāng)，可能會造成無信號、弱信號、高背景、有雜帶等實(shí)驗(yàn)問題，下表就此類實(shí)驗(yàn)問題給出案例分析和解決方案，供參考。
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實(shí)驗(yàn)問題 |
原因 |
解決方案 |
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無信號或信號弱 |
一抗不純或特異性低 |
重新選擇或制備高特異性的抗體，純化抗體 |
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抗體不工作 |
設(shè)置對照，分別檢查一抗、二抗是否能正常工作；檢查一抗及二抗種屬來源及亞型，正確選擇抗體 |
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抗體濃度低，孵育時間短 |
增加抗體孵育時間；降低洗滌強(qiáng)度。 |
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背景高 |
一抗?jié)舛雀?/td>
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優(yōu)化抗體濃度，推薦使用單抗 |
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二抗?jié)舛雀?/td>
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增加抗體的稀釋倍數(shù) |
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非特異性條帶 |
一抗不純或特異性低 |
重新選擇或制備高特異性的抗體，純化抗體 |
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二抗非特異性 |
只設(shè)置二抗對照，評估二抗影響 |
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反影或條帶為黃色 |
二抗?jié)舛雀?/td>
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增加抗體的稀釋倍數(shù) |
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以上是關(guān)于 Western Blot 實(shí)驗(yàn)過程中如何選擇合適的、高品質(zhì)抗體的一些建議，以及由于抗體選擇和使用不當(dāng)而造成實(shí)驗(yàn)失敗的問題總結(jié)，希望能給大家一些幫助和啟發(fā)。此外， Western Blot 還有很多關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)需要注意，比如怎樣制備高質(zhì)量的蛋白樣品、怎樣保護(hù)蛋白樣品不被降解、怎樣配制合適的 SDS-PAGE 凝膠等，在之后的篇章里會逐步為大家介紹。
