Western 熒光檢測(cè)取決于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—顯影和定影效率這一系統(tǒng)。我的經(jīng)歷認(rèn)為確保萬無一失的做法是如果看到熒光則壓 10~30s，看不到則同時(shí)壓兩張，10~30 min 洗一張，如果無則再補(bǔ)一張,1 h 后洗。再無，則壓過夜。共 3 張片，根據(jù)每次結(jié)果調(diào)整。
 

其中兩張片子的壓法如下描述: 先剪一張比膜長(zhǎng) 2~3 厘米的片子（以供貼膠帶），然后剪 2 片細(xì)小透明膠帶貼到片子的左右兩邊（貼時(shí)膠帶留一半用于粘到封口膜上），然后將片子壓到膜上，并使透明膠帶留出的一半粘到封口膜上。這樣就固定了**張膠片，就不會(huì)因?yàn)榉拧⑷〉诙埬z片而使**張移動(dòng)了。然后放第二張膠片，與**張片子貼在一起就行，注意片子要干燥，壓片前用紙擦干封口膜，以避免被底物液體污染導(dǎo)致與下面一張粘在一起。取時(shí)用手輕輕拂過就可以把上面片子與下面一張錯(cuò)開了，不要用手摳，否則下面一張也移動(dòng)了。 在洗下面一張片子時(shí)一定要取掉粘在片子上的膠帶，否則在膠帶的地方會(huì)影響顯影。熒光經(jīng)過下面一張膠片會(huì)稍微有些衰減，所以下面一張膠片感光稍微比上面一張強(qiáng)一些。
 

現(xiàn)象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解決

反影 (白色條帶, 黑色背景) ---- -- -1 HRP 過高 (背景較高) - - - - - - - - ---- - - - **少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 1

顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色---- - -2 HRP 過高 (敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 2

信號(hào)弱或無---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP 過高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 3

--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗體-抗原系統(tǒng)敏感性過低- --- - - - - - - 提高抗體濃度/蛋白上樣量*注 4

- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 轉(zhuǎn)膜不充分/過轉(zhuǎn)- -- -- - - -- - - - - ---- -優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件*注 5

-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP 或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----測(cè)試活性或選用敏感底物 *注 6

高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP 過高 (背景較高) - -- - - - - - - - - - -- **少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 7

---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封閉時(shí)間不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延長(zhǎng)封閉時(shí)間 4 度過夜**好*注 8

--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗體與封閉液有交叉----- - - - - - - - - - -更換封閉液 (如 3%BSA 的 TBST)*注 9

--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST 洗脫不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脫時(shí)間、次數(shù)、用量*注 10

---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光時(shí)間過長(zhǎng) - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光時(shí)間*注 11

- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗體濃度過高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗體濃度或蛋白上樣量*注 12

條帶內(nèi)無顯影的白點(diǎn)----------------13 轉(zhuǎn)膜不良（如有氣泡在膠-膜之間) -- -- 精細(xì)操作*注 13

--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按說明書平衡膜/戴手套用平頭鑷子持膜*注 14

---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜與 X 光片間有氣泡- -- - - - - - - - - - --顯影前去除氣泡*注 15

非特異性條帶- - - - - --------- -- - -16 抗體交叉反應(yīng)- - - - - - - - - - - -- -- - --**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 16

- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS 非特異性結(jié)合蛋白條帶 - - --- - ---使用無 SDS 轉(zhuǎn)膜液*注 17

散在小圓斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封閉液有雜質(zhì)顆粒- -- - --------- ------- 靜置牛奶使大顆粒沉淀，僅用上層*注 18
 

*注 1 其具體問題有二：一是背景較高, 二是沒有條帶. 形成機(jī)制為條帶處 HRP 很快將底物耗竭，則不發(fā)光不使膠片感光而為白色, 周圍因背景 HRP 較低而持續(xù)發(fā)光一段時(shí)間使膠片感光為黑色。這種常見于高濃度抗體并且封閉/洗脫不好的情況下。如果沒有背景則就是原因 3 的現(xiàn)象。在暗室可以看到條帶周圍熒光而條帶處為暗。如是則要么通過降低抗體解決，要么動(dòng)作迅速早期未耗竭底物時(shí)壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時(shí)間不能解決問題。也可以過一段時(shí)間鼿 RP 稍減后重加底物迅速壓片。還有另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色，原因和上面的一樣，主要是條帶中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的熒光帶，但與上面的區(qū)別主要在于特異性要好一些，若繼續(xù)發(fā)展則就是原因 3 的現(xiàn)象。其分析和解決同上。
 

*注 2 其原因主要是 HRP 太高超速催化底物生成的產(chǎn)物使膜發(fā)黃, 壓出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的現(xiàn)象同時(shí)存在，只是一種現(xiàn)象，在壓過的膜可以看出來（只在加底物后一段時(shí)間出現(xiàn)，幾小時(shí)后可能還會(huì)消退，有時(shí)甚**剛加底物 1~2 min 就可以看出來，所以要把握時(shí)機(jī)）。如果沒有達(dá)到原因 1 和原因 3 的程度，那么這種情況一定能夠看到很強(qiáng)的熒光，是一種良好的狀態(tài), 是我們所期盼的。如果壓出正常片子而不出現(xiàn)原因 1 和原因 3 的現(xiàn)象, 可以不予處理。但因?yàn)闊晒馓珡?qiáng)極易導(dǎo)致條帶增粗變大，所以也可以不稀釋抗體而通過調(diào)整壓片時(shí)間來解決，一般壓 10s~30s，甚**可以 3~5s，即時(shí)根據(jù)結(jié)果在暗室調(diào)整, 熒光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的話都可連續(xù)壓十?dāng)?shù)張片子而效果良好。但也有這種情況，就是由于 HRP 過強(qiáng)無論怎么減少壓片時(shí)間條帶都依然粗大（如果時(shí)間過短如<3s則可因感光不足導(dǎo)致條帶太淡，這樣就不可取了，但依然是粗大的、非條帶的本來面目），那么如果想獲得漂亮條帶則必須通過降低抗體濃度（減少上樣量很不穩(wěn)定且能力有限，故很少使用）來解決。原因1和3若如是則解決也是一樣的。#p#分頁標(biāo)題#e#
 

*注3 這是與1類似但抗體特異性較好時(shí)的一種表現(xiàn)，經(jīng)常與下面的原因4、5、6混淆，特別需要注意。主要出現(xiàn)在HRP極高的情況下，來不及壓片就已耗竭底物，往往伴有原因2的現(xiàn)象。可通過加入底物后迅速進(jìn)入暗室觀察熒光確定，也可以根據(jù)原因2的現(xiàn)象確定，以區(qū)分于原因4、5、6。除非動(dòng)作迅速早期未耗竭底物時(shí)壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時(shí)間不能解決問題。也可以過一段時(shí)間待HRP稍減后TBST簡(jiǎn)單洗膜重新加底物壓片。這種情況下一/二抗稀釋可高達(dá) 10 倍而依然熒光明顯。
 

*注4 提高抗體上樣量以及下述的使用敏感底物/延長(zhǎng)壓片時(shí)間比較簡(jiǎn)單, 在此不贅述，只提醒一下隨抗體濃度增高背景和非特異性可能會(huì)增加。關(guān)于上樣量的極限在此發(fā)表我的看法：對(duì)于裂解的混合蛋白以上樣孔底面積(平方毫米)乘30ug作為極限上樣量，而落實(shí)到每一個(gè)具體條帶（同一分子量的所有蛋白或僅做單一蛋白電泳），則以0.3ug/平方毫米底面積作為極限上樣量。(見《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》的免疫印跡一章)，超過此量可能會(huì)導(dǎo)致條帶變形。條帶信號(hào)弱可以通過加大上樣量/提高抗體濃度/使用敏感底物/延長(zhǎng)壓片時(shí)間解決。但實(shí)際上樣量的極限并不以我說的極限上樣量為準(zhǔn)，因?yàn)檫@個(gè)極限上樣量是確保所有分子量的條帶都跑的很漂亮的極限, 而上樣超量的表現(xiàn)是隨量的加大變形的條帶由低分子量逐漸往高分子量延伸。所以western極限上樣量的真正操作標(biāo)準(zhǔn)是以目的條帶不變形作為極限。比如對(duì)于150kd，完全可以超出我所說的極限上樣量的2倍而不變形（此時(shí)中低分子量條帶早已融合或擠為棒槌形了）
 

*注5 對(duì)于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不會(huì)出現(xiàn)過轉(zhuǎn)情況，轉(zhuǎn)膜不充分是主要原因，增加轉(zhuǎn)膜力度無非是加大電壓/電流，延長(zhǎng)時(shí)間。但對(duì)于小分子蛋白（<30kd 就要注意了，<15kd 尤其要當(dāng)心）很可能出現(xiàn)過轉(zhuǎn)，麗春紅染膜或觀察 marker 有沒有穿膜可以確認(rèn)，沒有麗春紅也可以考染轉(zhuǎn)膜后的膠，如果是一片空白，則要小心了，可適當(dāng)降低轉(zhuǎn)膜力度。對(duì)于低分子量一般轉(zhuǎn)膜液不要加 SDS 以防過轉(zhuǎn)，《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》提供的針對(duì)中低分子量的濕轉(zhuǎn)緩與高分子量的相比也是不含 SDS 的。
 

*注 6 測(cè)試 HRP 或底物活性：于暗室 EP 管加底物 A、B 液各 500ul，加入 1ul HRP 偶聯(lián)二抗，若底物立即發(fā)出藍(lán)光并于隨后數(shù)分鐘內(nèi)消失說明 HRP 和底物尚好。此外試劑公司還開發(fā)一些超級(jí)底物，其敏感度可達(dá)到 pg 級(jí)，但價(jià)格昂貴，對(duì)某些表達(dá)較低的蛋白效果會(huì)好些，而且也超級(jí)省抗體（其推薦抗體稀釋比高達(dá)1:10,000 以上）。我用的是敏感度為 ng 級(jí)的底物，大部分 western 都還可以，pg 級(jí)的還放在手里，沒舍得用。
 

*注 7 高背景原因是因?yàn)?HRP 偶聯(lián)二抗結(jié)合到膜上，其原因包過直接結(jié)合、通過膜上蛋白間接結(jié)合、通過一抗（主要指多抗中的雜抗體）間接結(jié)合、通過封閉物（與封閉物交叉反應(yīng)）間接結(jié)合、洗脫不徹底等原因造成的。在稀釋抗體降低背景的同時(shí)也會(huì)降低對(duì)目的蛋白的結(jié)合效率，意即以犧牲信號(hào)強(qiáng)度為代價(jià)。不過在此提出另外一種和稀釋抗體恰相反的做法——提高抗體濃度。這種辦法適用于 HRP 結(jié)合到膜上較多而且底物相對(duì)極其敏感（如 pg 級(jí)底物，因極其敏感可把結(jié)合到膜上的極其微量抗體產(chǎn)生的背景也顯示出來，而這種背景在 ng 級(jí)底物即使壓片過夜也沒有顯示），無論如何稀釋抗體和加強(qiáng)洗膜都不能消除背景或者條帶和背景隨稀釋呈等比例遞減甚**條帶遞減速度比背景還快，如果稀釋抗體則壓片時(shí)間需延長(zhǎng)而背景反而因此更加明顯。這種情況下認(rèn)為需要提高抗體含量以提高條帶顯示程度，而背景隨抗體濃度提高并不加強(qiáng)的很厲害，如是則可以通過減少壓片時(shí)間而達(dá)到突出條帶降低背景的目的（我**近帶一個(gè)研究生使用 pg 級(jí)超級(jí)底物時(shí)發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象并使用此方法解決背景高的難題，當(dāng)時(shí)一抗稀釋為原來的 4 倍，二抗稀釋為原來的 10 倍，即總稀釋為原來的 40倍仍然可以看到背景的熒光但條帶的熒光卻減了許多導(dǎo)致條帶和背景都無法區(qū)分了，后來回復(fù)原來濃度并稍微延長(zhǎng)孵育時(shí)間則條帶熒光明顯蓋過背景并減少壓片時(shí)間** 5s 解決）。
 

*注 8 這一點(diǎn)似乎多數(shù)人都不重視，所以有時(shí)候會(huì)有些意外。我一般室溫 2~4 h，但 4 度過夜確實(shí)是**好的。另外在平皿中搖似乎比封口膜更容易掌握并獲得較好的效果，對(duì)新手似乎更好。
 

*注 9 實(shí)際上牛奶對(duì)于多數(shù)抗體來說還是很好的，但所有二抗也都寫著：與牛奶可能有交叉反應(yīng)。BSA 蛋白單一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。單用 TBST 也可以，此法雖然減少了交叉，但單就封閉能力而言卻也因此而降低。
 

*注 10 一般 10 min*3 次就足夠了，如果不放心可按自己意志加強(qiáng)時(shí)間、次數(shù)、洗脫液用量。
 

*注 11 以犧牲敏感度為代價(jià)其**低標(biāo)準(zhǔn)是使目的條帶能夠正常顯影，對(duì)一切原因有效，但效果局限。
 

*注 12 以犧牲敏感度為代價(jià)其**低標(biāo)準(zhǔn)是使目的條帶能夠正常顯影，僅對(duì)膜上蛋白和一抗引起的有效。
 

*注 13 主要是氣泡在膠-膜之間引起的絕緣區(qū)使蛋白無法通過而不能到達(dá)膜上，這一步在操作時(shí)尤其要小心，我自己犯過，也看到其他人犯過。我的辦法是把膠鋪到膜上，先使其一邊接觸膜的一邊，這樣就會(huì)在膠和膜交界的地方形成一個(gè)水相前緣，然后慢慢落下凝膠，這樣這個(gè)水相前緣就會(huì)逐漸推進(jìn)直**膠膜重合，如是則不會(huì)有氣泡產(chǎn)生。把膠鋪到膜上而非相反是因?yàn)槟z是透明的，可以看到水相前緣以及有無氣泡產(chǎn)生。#p#分頁標(biāo)題#e#
 

*注 14 膜平衡不均或有油脂污染的表現(xiàn)是膜上有疏水的通明色和蛋白幾無（麗春紅染），這點(diǎn)并不多見。
 

*注 15 這一點(diǎn)我是抄 pierce 的說明書的，我沒遇到過，膜與 X 光片間有氣泡也不影響熒光通過，這個(gè)我可以肯定。似乎不透明的東西才會(huì)導(dǎo)致。
 

*注 16 非特異性條帶在普通多抗比較多見，純化多抗會(huì)好的多，但單抗也不是**沒有，我也遇到過。關(guān)于 wetern 的抗體選擇在此提出我的觀點(diǎn)：**理想的是混合單抗，其次是純化多抗，單抗和多抗各有局限和特點(diǎn)，根據(jù)個(gè)人對(duì)特異性需求和蛋白的穩(wěn)定性而定。

考慮的參數(shù)主要是抗原表位和特異性兩個(gè)因素，不包含每個(gè)抗體價(jià)格。混合單抗雖然針對(duì)多個(gè)表位但代價(jià)太高，需購置多個(gè)單抗然后混合，很少有人這么做。純化多抗基本具有混合多抗的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)，表位多，穩(wěn)定性好，特異性也不差，我覺得是實(shí)際中的**。單抗雖然特異性好，但如果其針對(duì)的表位在提取蛋白時(shí)被破壞則其敏感度為會(huì)下降甚**為 0，故不穩(wěn)定。普通多抗雖然表位多，但因含其他抗體，特異性差了好多，會(huì)有很多雜帶乃**背景。實(shí)際我做的抗體多數(shù)都是普通多抗，只要封閉的好，效果還是很不錯(cuò)的；單抗雖說不穩(wěn)定，但實(shí)際中我都能做出來，尤其是內(nèi)參，強(qiáng)烈推薦只選單抗。
 

*注 17 此點(diǎn)我根本不知道，完全是拷貝 pierce 說明書的。
 

*注 18 主要原因是牛奶里面會(huì)有一些不懸浮的大顆粒，這些東西對(duì)封閉無益。我所有的牛奶全是配好后在 4 度靜置（**好放在尖底的管子內(nèi)），這樣那些大顆粒就會(huì)沉淀到底部，吸取時(shí)不要擔(dān)心牛奶不均而特意混勻，我只吸上面的，下面的顆粒則不要取。如是則在也沒有遇到這種現(xiàn)象。不推薦過濾牛奶，因?yàn)楹臅r(shí)極長(zhǎng)且得率極低。我用過幾次但后來廢棄了這種做法。