1、抗體的選擇
對于國內(nèi)的大多數(shù)實驗室來講，做western blot實驗選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單，買進口抗體捉襟見肘，買國產(chǎn)抗體得需要大無畏的勇氣，對于我所在的蘭州地區(qū)的實驗者而言，感觸尤深。
在這五年的western blot實驗歷程里，我先后用過進口抗體，進口抗體國內(nèi)分裝包裝，國產(chǎn)抗體，質(zhì)量良莠不齊。 進口抗體一般不會出現(xiàn)閃失：abcam品種全，質(zhì)量過硬，但價高（3400元/100微升），而且說是100微升，但**多能吸出來90微升；Sigma的價**貴；比較有性價比的是CST的抗體，現(xiàn)在好像是2200元/100微升，我前后用過二十幾種， 1:1000的稀釋比下，還沒有失過手，100微升通常能完成所有的免疫組化和western blot實驗，還有一個優(yōu)點是通常量比100微升多出來10微升，**的不足是CST的品種實在不多。Santa的多克隆抗體質(zhì)量可以，但是選用Santa的單抗還是有風險，估計這也是業(yè)界共識了吧。
進口抗體國內(nèi)分裝包裝我也用過不少，呵呵，畢竟是窮人（420元/100微升），大概好抗體的比例約為50%，如果能做出來，也存在一個問題，就是抗體大多只能用一次。我曾經(jīng)把Santa的原裝抗體和分裝抗體做過比對（抗體品種，貨號等完全一致），在都能做出來的前提下，原裝抗體能重復使用的次數(shù)要多出許多。具體原因我已經(jīng)揣測了好幾年，不敢說出來，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整個賣，也會有所不同。揣測歸揣測，假如只為了發(fā)論文畢業(yè)走人，可以考慮選用進口分裝的多克隆抗體。
國產(chǎn)抗體比較知名的就幾家，但質(zhì)量確實不敢恭維。western blot能做出來的確實不多，而且雜帶多，背景不干凈。我們周邊的實驗室大多買國產(chǎn)抗體做免疫組化，怎么說呢，應付碩士論文夠了。
我也幫別人自制過抗體，再用抗原親和純化。效價非常不錯，夸張的時候1：10000都能做出條帶，**的麻煩是兔子太騷（騷臭），不知道這是不是“兔女郎”名號的來由。
如果讀書非常悠閑，老板又特別想擁有手工作坊的情況下，可以自己伺候折騰兔子來玩玩，剛開始的時候還是蠻有成就感的。只是單憑抗原表達和制備多抗，是不是可以寫成論文畢業(yè)，估計因校而異了。

2、Western Blot設備
目前**好的垂直槽和轉(zhuǎn)移槽還是Biorad（伯樂），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四塊膠，但通常用不上，由此造成垂直緩沖液的浪費，而且MINI4用綠色塑料夾住玻璃板來組成內(nèi)槽，容易漏液，塑料夾應該是有疲勞壽命的，估計日子一長，彈性就會改變，所以如果你們實驗室剛買了MINI4，趕緊用，遭殃的肯定是某一級的師弟師妹們。 Biorad的一套系統(tǒng)得兩萬多，西部能玩得起伯樂的還真不多。
好在咱中國人聰明，上海天能的外觀和構造和伯樂的MINI3幾乎一模一樣，而且可以通用，不帶電泳儀是5千多一套，挺好用的。**的不足是塑料壽命不如伯樂，膠架容易斷裂。不過仔細算算，三套天能也就是一套伯樂的價格，值了。
北京六一的垂直槽很轉(zhuǎn)移槽很好用，但垂直槽配膠不方便，玻板太厚，散熱不好，但能用，六一的電泳儀（電源）還是很好用的。

3、Western Blot實驗條件
Western Blot實驗條件我基本是按ABCAM公司經(jīng)典教材做的，按以下的網(wǎng)址下載下來就可以了（http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。具體的試劑配方我是按寶生物試劑冊的附錄部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是從北京華美買的德國biomol原裝貨，配出來的膠可以提在手里玩，彈性非常好，價格比sigma的便宜許多，1公斤好像是480多人民幣，夠?qū)嶒炇矣煤瞄L時間，現(xiàn)在我們實驗室做雙向電泳都用biomol的膠，很好用。
Marker我現(xiàn)在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了，蘭州的代理是上海生工。
要強調(diào)的是垂直電泳緩沖液千萬不能回收用，具體愿因你只需上網(wǎng)查查SDS-PAGE的原理就知道了。轉(zhuǎn)移電泳緩沖液可以回收再用兩次。 轉(zhuǎn)膜我通常是快轉(zhuǎn)兩百200毫安/2小時，慢轉(zhuǎn)80毫安/12小時。
快轉(zhuǎn)是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。 封閉我通常用BD的脫脂奶粉，不歸，260元500克，也是從北京華美買的。 ECL我用pierce的，500毫升1650元，比國產(chǎn)的還便宜好用。 膠片是柯達的，以前用過樂凱的，不如柯達。 我很少用麗春紅或考馬斯染膜或染