電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同

的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。

# p# w8 ^# {: r% M' G

 

    電泳過(guò)程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。Tiselius等在1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒(méi)有固定支持介質(zhì)，所以擴(kuò)散和對(duì)流都比較強(qiáng)，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過(guò)程，減少了擴(kuò)散和對(duì)流等干擾作用。**初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜，目前這些介質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用得較少。在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，小分子物質(zhì)如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質(zhì)的電泳進(jìn)行分離、分析，但目前則一般使用更靈敏的技術(shù)如HPLC等來(lái)進(jìn)行分析。這些介質(zhì)適合于分離小分子物質(zhì)，操作簡(jiǎn)單、方便。但對(duì)于復(fù)雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進(jìn)了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。**初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得**多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺

凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。 

     電泳裝置主要包括兩個(gè)部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng)，驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見(jiàn)的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開(kāi)，在玻璃平板中間制備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm  14 cm，厚度為1mm～2? mm，近年來(lái)新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節(jié)省試劑和縮短電泳時(shí)間。制膠時(shí)在凝膠溶液中放一個(gè)塑料梳子，在膠聚合后移去，形成上樣品的凹槽。水平式電泳，凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液，或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會(huì)引起帶電分子電荷的改變，進(jìn)而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過(guò)程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的，緩沖液可以保持待分離物的帶電

性質(zhì)的穩(wěn)定。 

    為了更好的了解帶電分子在電泳過(guò)程中是如何被分離的，下面簡(jiǎn)單介紹一下電泳的基本原理。在兩個(gè)平行電極上加一定的電壓（V），

就會(huì)在電極中間產(chǎn)生電場(chǎng)強(qiáng)度（E），L是電極間距離。

4 _$ P7 ^5 I5 H2 R/ F

 

    在稀溶液中，電場(chǎng)對(duì)帶電分子的作用力（F），等于所帶凈電荷與電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積。這個(gè)作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過(guò)程中，分子會(huì)受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力（F’）的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)，并與帶電分子的移動(dòng)速度成正比，對(duì)于球狀分子，F(xiàn)’的大小服從Stokes定律，即：F’=6πrηυ式中r是球狀分子的半徑，η是緩沖液粘度，υ是電泳速度(υ= d / t，單位時(shí)間粒子運(yùn)動(dòng)的距離，cm / s )。當(dāng)帶電分子勻速移動(dòng)時(shí)： F = F’，q?E = 6πrηυ

由此可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。 

       用SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)，實(shí)際使用的是相對(duì)遷移率mR。帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過(guò)程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開(kāi)。即使兩個(gè)分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過(guò)程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離，如等電聚焦電泳；而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過(guò)程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如SDS－聚丙烯酰胺

凝膠電泳。分離后的樣品通過(guò)各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標(biāo)記，則可以通過(guò)放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測(cè)。 

凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)原理 

6 q& E, u6 R# B$ U6 

 

  聚丙烯酰胺凝膠電泳，普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp**近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚**相差1bp的DNA片段就能分開(kāi)。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對(duì)大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。

聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。  

* {) {, |)  Y% ^9 D& [. B  H-  #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

瓊脂糖凝膠電泳原理： 

       瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的，主要是由D－半乳糖和3,6脫水L－半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1％－3％，加熱煮沸**溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對(duì)流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過(guò)瓊脂糖的**初濃度來(lái)控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒(méi)有電荷，但一些糖基可能會(huì)被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面

帶有一定的電荷，引起電泳過(guò)程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。 

     瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳支持介質(zhì)，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1％的瓊脂糖凝膠的孔徑對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是比較大的，對(duì)蛋白質(zhì)的阻礙作用較小，這時(shí)蛋白質(zhì)分子大小對(duì)電泳遷移率的影響相對(duì)較小，所以適用于一些忽略蛋白質(zhì)大小而只根據(jù)蛋白質(zhì)天然電荷來(lái)進(jìn)行分離的電泳技術(shù)，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過(guò)程中會(huì)存在一定的摩擦阻礙作用，這時(shí)分子的大小會(huì)對(duì)電泳遷移率產(chǎn)生明顯影響。例如對(duì)于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關(guān)，而與堿基排列及組成無(wú)關(guān)。另外，一些低熔點(diǎn)的瓊脂糖（62 C時(shí)熔化，因此其中的樣品如

DNA可以重新溶解到溶液中而回收。 

       由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應(yīng)用得相對(duì)較少。 

目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳，其優(yōu)點(diǎn)如下： 

1） 瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。

* l9 Z3 w" V0 ]6 ^, D

 

2） 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由電流，對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分

辨率高，重復(fù)性好。 

3） 瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。 4） 電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。 

" ], R. ~+ c6 h: ~

 

聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：0 |( F# p# ?2 G6 v* x9 x-  

       聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，這一聚合過(guò)程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通常是加入催化劑過(guò)硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基。溶液的pH對(duì)聚合作用是重要的，因?yàn)檫^(guò)低pH沒(méi)有足夠的堿基加速催化反應(yīng)，同樣過(guò)多的氧分子存在，會(huì)使聚合作用很快停止。所以制備凝膠時(shí)，在加過(guò)硫酸銨之前，混合物必須抽去空氣。核黃素催化的聚合作用，常用于制備濃縮膠，因?yàn)檫@樣制得的凝膠孔度要大些。核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)，產(chǎn)生自由基使Acr

發(fā)生聚合作用。 

  

    聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過(guò)改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來(lái)控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3％的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA；高濃度凝膠具有較小的孔徑，對(duì)蛋白質(zhì)有分子篩的作用，可以用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離的電泳中，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)公式是：C = 6.5－0.3T此式可用于計(jì)算T為5％～20％時(shí)的凝膠組成。C值并不很嚴(yán)格，在大多數(shù)情況下，可變化的范圍約為 1％，當(dāng)C保持恒定時(shí)，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4％時(shí)，有效孔徑**小，C大于或小于4％時(shí)，有效孔徑均變大，C大于5％時(shí)凝膠變脆，不宜使用，實(shí)驗(yàn)中**常用的C

是2.6％和3％。

6 ]" p/ ^/ w: H+ e' a

 

    由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優(yōu)點(diǎn)，因而四十年來(lái)得到廣泛的應(yīng)用，目前尚無(wú)更好的支持介質(zhì)能夠取代它。其主要的優(yōu)點(diǎn)有： 

1、 可以隨意控制膠濃度“T”和交聯(lián)度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。

( x% X2 Y5 Y; u% c1 m

 

2、 能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度：10－9 ～10－12 mol/L。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

! E% # b9 f7 p3 p! m( R' X

 

3、 由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2 ，沒(méi)有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰

性好，電泳時(shí)不會(huì)產(chǎn)生“電滲”。

% T: W+ F+ m+ Z$ a2 ]) _

 

4、 由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。 

5、 透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。 

6、 無(wú)紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長(zhǎng)的凝膠掃描作定量分析。

$ H3 A% m# F& ?1 [: m/ ^

 

7、 還可以用作固定化酶的惰性載體。核酸電泳指示劑的選擇 

指示劑：

- g# V5 u# ?& Q9 ]1 d) o  ^5 b

 

       核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青及銀染色.溴酚蘭在堿性液體中 呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈蘭色，它在 1%和1.4%瓊

脂糖中電泳時(shí)，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似。

3 [& m) v0 M- o+ S

 

指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液.載樣緩沖液的作用有： 1、 增加樣 品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。

) I6 H" ]2 T8 7 @' [/ L

 

2、 在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指 示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。 

3、 使樣品呈色，使加樣操作更方便。 

+ ]% ! i1 G* ]7 q# p! s- y( t+  

染色劑：

! v" Q/ [6 l( U6 E( T% i* w

 

   核酸電泳后，需經(jīng)染色后才能顯現(xiàn)出帶型，**常用的是溴化乙錠染色法，其次是銀染色。( S( U) ~$ {. W( b

 

   溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光.根據(jù)情況可在凝膠電泳液中加入終濃度為 0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10～15min.瓊脂 糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng，當(dāng)溴化乙錠太多，凝膠染 色過(guò)深，核酸電泳帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min

后再觀察。 

  銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛 使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色.主

要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色. 也用于瓊脂糖凝膠染色.其靈敏度比EB高200倍.但銀染色后，DNA不宜回收。 

瓊脂糖凝膠電泳 

5 o0 l! T6 {: {( J# s' m'  

主要試劑： 

  核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀.TAE緩沖容量低，但價(jià)格較便宜，因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合二價(jià)

陽(yáng)離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物降解。

; y! P) z/ v7 ~3 D1 n; Q

 

核酸分離一般用連續(xù)緩沖體系，常用的有：

8 f5 {% p7 |! _+ a

 

1) TBE：0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA 2) THE：0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/l EDTA 

; }, O; Y- P9  

主要實(shí)驗(yàn)步驟：" |, j( H& a( e' U! ~( j. ?

 

1、 用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈.放在水平桌面上，并架好梳子。# h& N' |' a' v0 u% i+ J. i

 2、 取5×TBE緩沖液20ml加水**200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。 

! U; ~  h# X# M7 h1  

3、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱**瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水

份蒸發(fā)。 

4、 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷卻**50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液**液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。因邊緣

效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。

1 X6 i% D0 k9 H: R3 A9 X

 

   瓊脂糖濃度的配置可參照下表#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#